前言 大肠癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，在我国已位居第四位，死亡率呈逐年上升趋势。探讨有效的诊断和治疗手段是大肠癌研究的重要课题。近年来以单克隆抗体(单抗)作为载体的大肠癌导向诊断和治疗取得了一定进展，但由于鼠源性抗体带有较强的免疫源性，多次给药易产生人抗鼠抗体(HAMA)，同时完整抗体分子过大(Mr150000)，难以穿透肿瘤毛细血管，一定程度上限制了其临床应用。为此，采用基因工程技术将鼠源性抗体进行改造，制备新型抗体成为近年抗体研究的重要课题，如：制备人-鼠嵌和抗体、人源化抗体、单链抗体等，均可不同程度克服上述缺陷。 单链抗体是目前应用最为广泛的重组抗体，它由抗体分子中构成抗原结合部位的重链可变区和轻链可变区借助一连接短肽连接而成。相对完整抗体及Fab抗体片段，单链抗体的优势在于分子量较小(Mr30000，相当于完整抗体的1／6)，使其能够迅速渗透到实体瘤内部，此外，由于没有Fc段，免疫源性大大降低，同时不能与非靶细胞的Fc受体结合，更利于集中到达肿瘤部位，使其有可能成为肿瘤诊断和治疗的导向载体。 ND-1是宋今丹于1986年以人大肠癌细胞系CCL-187为免疫源制备的鼠抗人大肠癌单克隆抗体，已进行的近千例临床血清和病理组织检测显示，该单抗对高中分化大肠癌组织具特异结合活性，并优于目前广泛采用的美国商业产品抗CEA单抗。方瑾于2001年将抗人大肠癌单克隆抗体ND-1的重链可变区和轻链可变区基因进行重组构建了单链抗体ND-1 scFv，并成功地在大肠杆菌中进行了有效表达，体外实验证实具有较好的免疫学活性。 在上述研究基础上，本实验用“Tc标记抗人大肠癌ND一1scFv，通过动物体内放射免疫显像实验、生物分布实验及药代动力学参数的测定，进一步证实其在体内的生物学活性，为大肠癌的临床诊断和治疗提供依据。实验材料与方法 6一8周龄Ba]Lb/C纯系雌鼠腹腔注射Ic一2杂交瘤细胞，使其产生腹水，腹水经处理后，以IgG亲和层析柱凡Trap层析分离，接收活性峰，得到完整抗体ND一1 IgG。将ND一1 scFv阳性克隆菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，任缪G诱导表达，Ni-NTA resin亲和层析柱层析分离，以pHS .0、pH6.5、pH4.2的smoFL尿素洗脱层析柱，接收pH4.2组分，4℃复性并透析，获得单链抗体ND一1 scFv。sDs一PAGE及凝胶灰度扫描测定抗体蛋白纯度，Bradford法测定蛋白浓度，间接免疫荧光法测定活性，一加℃保存备用。 取4一6周龄B山/c纯系雌性裸鼠背部皮下接种人大肠癌细胞ccL一187。待肿瘤长至0.5一1.SCm，经尾静脉注射99mTc一ND一1 se肠，于注射后一h，3h，sh，12h，24h进行放射免疫显像。显像后处死裸鼠，取眼球血、肿瘤、心、肝、脾、胃、大肠、大腿骨骼、大腿肌肉、肾、肺等组织称重，测定放射性计数，并计算T/NT比值。 取B山/。萄瘤裸鼠分别经尾静脉注射99mTc一ND一11步及卯mTc一ND一1 seFv，于注射后0而n、smin、10而n、30而n、lh、Zh、3h、6h、12h和24h剪尾取血，测定血样放射性计数，绘制血浆清除曲线，并计算清除参数。实验结果 ND一lscFv及ND一11步经纯化后采用SDS一PAGE电泳进行分析检测，结果显示单链抗体在30KD处呈现一单一条带，分子量与ND一1 scFv理论值相符;完整抗体在25KD和55KD处显示为均一的两条带，分子量与ND一1重链、轻链理论值相符。经光密度扫描显示两种蛋白纯度均大于90%，且间接免疫荧光结果显示单链抗体及完整抗体均有良好的抗体免疫活性。 用纸层析法测定99mTc对单链抗体及完整抗体的标记率均大于95%，可用于动物体内放射免疫实验。 放射免疫显像结果显示，99mTc标记的单链抗体于注射后1小时即开始在肿瘤部位呈现特异性聚积，3小时呈像清晰。 动物体内生物分布结果表明，99mT。一ND一1 scFv注人荷瘤裸鼠体内后，在各正常组织中的T/NT值随时间推移不断增大，至3小时大部分组织的T/NT比值均>1 .2。 动物体内药代动力学结果显示，单链抗体的血清除符合二室模型，在体内的分布半衰期Tl二。为5·7而n，消除半衰期Tl那为2·6h，而完整抗体分别为60而n和18h。单链抗体在体内比完整抗体分布快，排泄迅速。’讨论 获得具有高度特异性并在体内具有良好生物学行为的抗体一直是抗体应用研究的关键问题。单链抗体由于其明显的应用优势自出现以来即受到广泛关注，目前国内外已构建完成多种针对肿瘤的单链抗体，并在体内外应用的可能性上进行了多方面的探索。本研究在本室构建完成的抗人大肠癌单链抗体ND一1 scFv基础上，对同位素99mTc标记的ND一1 seFv在荷瘤裸鼠体内的生物学特性进行了检测，结果表明ND一1 scFv在动物体内呈现良好的特异性分布和较好的药代动力学特性。 完整抗体在构建为小分子抗体后，其分子量通常只有原分子的1/3或1/6，较小的分子量使其对肿瘤组织的穿透性显著提高。相关的实验观察证实完整抗体主要浓集于血管附近，而scFv可均匀地分布于肿瘤内部，高效发挥导向作用。同时，scFv在动物体内