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原始生殖细胞（PGCs）是生殖细胞的祖细胞，在胚胎发育的早期形成后迁移到性腺原基，成为性原细胞，并最终发育成两性配子。近年来，由于对性别分化机制研究的不断深入，生殖细胞的发生发育和分化日益成为科学研究的热点。鱼类生殖细胞标记基因的研究将为深入开展鱼类生殖细胞发生发育、迁移和性别分化研究奠定坚实基础，同时对鱼类种质资源保存和繁殖育种都具有重要的理论意义和应用价值。然而目前海水养殖鱼类生殖细胞标记基因的相关研究较少。半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）是我国重要的海水养殖经济鱼类。而半滑舌鳎雌鱼比雄鱼生长快且个体大，在养殖条件下生理雌鱼比例低、不能自然产卵且产卵量有限，限制了舌鳎养殖业的快速发展。全雌苗种的培育和代理繁殖技术可以解决上述问题，但是对半滑舌鳎性别分化机制缺乏深入了解和生殖细胞标记基因的研究非常有限，成为制约相关研究开展的重要因素。本研究通过RACE和PCR结合的方法克隆了半滑舌鳎生殖细胞标记基因vasa、nanos、dnd和pou2全长cDNA和DNA序列，分析这些基因的序列特征。通过荧光定量PCR分析这些基因在胚胎发育过程、成鱼各组织以及伪雄鱼性腺的表达特征，着重研究这些基因在性腺分化期雌雄性别表达差异，初步探讨它们的功能，并利用原位杂交技术研究vasa、nanos和dnd基因在生殖细胞发育中的表达情况；同时采用染色体步移和PCR扩增技术克隆了vasa、nanos、dnd和pou2基因5’和3’调控序列，并通过在线软件预测这些基因启动子潜在的转录因子（TF）结合位点，进而构建vasa和nanos基因调控序列与绿色荧光蛋白（GFP）基因的融合表达载体并在模式鱼青鳉上采用转基因和RNA定位表达技术验证了其功能。本研究为半滑舌鳎原始生殖细胞的标记和操作（分离、冷冻保存和移植等）奠定了基础，同时为半滑舌鳎的性别分化机制和生殖细胞发生发育研究提供了基础资料。主要研究结果如下：1.序列分析结果表明，半滑舌鳎Vasa氨基酸序列（CsVasa）具有DEAD-box家族蛋白8个保守基序；进化分析显示CsVasa属于硬骨鱼类Vasa蛋白分支并和塞内加尔鳎聚在一起。原位杂交结果表明半滑舌鳎vasa基因（Csvasa）在生殖细胞中特异表达。定量PCR结果显示Csvasa主要在性腺中表达，在伪雄鱼性腺的表达量显著低于正常雌雄鱼性腺，在胚胎发育中表达量总体呈逐渐降低的趋势，Csvasa基因在性别分化期的表达呈典型的性别二态性。2.预测Csvasa基因5’侧翼序列（5.2kb）的一些典型的TF结合位点，进而构建pCsvasa-GFP-T和GFP-Csvasa3’UTR质粒，通过显微注射技术发现Csvasa启动子具有驱动GFP转录的功能和Csvasa3′UTR能够标记青鳉发育过程中的PGCs。3.舌鳎Nanos序列（CsNanos）分析发现其序列具有两个保守的CCHC锌指结构域，进化分析表明CsNanos归为Nanos2分支。原位杂交结果显示Csdnd主要在性腺生殖细胞中表达。荧光定量PCR结果表明Csnanos在性腺中表达量最高，其次是肝脏，其余组织的表达量相对较低，伪雄鱼表达量显著低于正常雌雄鱼，胚胎发育期呈现先升高后降低的表达趋势，Csnanos在性别分化期呈现性别二态性表达特征。4.预测Csnanos基因5’侧翼序列（3.7kb）TF结合位点，构建了GFP-Csnanos3′UTR载体，体外合成融合GFP和Csnanos3′UTR的杂合mRNA，通过显微注射技术发现Csnanos基因3′UTR能够标记青鳉胚胎发育过程中的PGCs。5.半滑舌鳎Dnd序列（CsDnd）分析发现其包含RNA识别基序RRM、CR1~4、NR在内的6个保守基序，进化分析显示CsDnd属于Dnd家族硬骨鱼分支。获得舌鳎dnd基因（Csdnd）5’侧翼序列2.7kb和3’侧翼序列1.8kb，分析了半滑舌鳎Csdnd5’侧翼序列潜在TF结合位点。原位杂交结果显示Csdnd在性腺生殖细胞中特异表达。定量PCR结果表明，Csdnd主要在性腺中表达，伪雄鱼性腺Csdnd表达量显著低于正常雌雄鱼，Csdnd在胚胎发育过程中呈降低的趋势，Csdnd在性别分化过程中呈性别二态性表达特征。6.舌鳎Pou2序列（CsPou2）分析发现其包含Pou家族的POUs和POUh两个保守结构域，进化分析显示CsPou2归为Pou家族的Pou2分支。获得舌鳎pou2基因（Cspou2）5’侧翼序列4.1kb和3’侧翼序列1.7kb，在线分析了Csdnd5’侧翼序列潜在TF结合位点。定量PCR结果显示，Cspou2表达主要分布在雌鱼性腺中，在雄鱼和伪雄鱼性腺几乎检测不到，Cspou2在胚胎发育过程中表达量也呈降低的趋势，性别分化期呈性别二态性表达特征。