研究背景及意义:斑马鱼具有繁殖能力强、发育迅速、胚胎呈透明等优点,而且基因组与人类基因组的同源性高达80%以上,是目前应用广泛的模式动物。斑马鱼的尾鳍具有强大的再生能力,通过对其再生机制的研究,将会给再生医学的发展带来很多启示。蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,在细胞的粘附、识别、相互作用等过程中发挥重要作用,与动物胚胎发育及多种疾病的发生发展密切相关。然而,蛋白糖基化修饰在斑马鱼尾鳍再生中的作用目前尚不清楚。因此,本研究拟探讨斑马鱼尾鳍再生过程中的糖基化模式并探明其作用机制,为进一步阐明斑马鱼尾鳍再生机制提供有益参考。方法:本研究共分为五部分:1.运用凝集素芯片技术,对斑马鱼尾鳍再生过程中蛋白质糖基化变化情况进行检测,分析比较其中的差异,并通过凝集素组化和凝集素印迹实验进行验证;2.利用MALDI-TOF-MS质谱技术对糖链进行鉴定,获得斑马鱼尾鳍再生过程中N-和O-糖链的指纹图谱;3.采用化学酶标法富集斑马鱼尾鳍再生组织中的O-GlcNAc糖蛋白,通过LC-MS/MS技术对其进行鉴定;4.通过PCR技术分析糖基转移酶ogt和糖苷酶oga转录水平差异,利用原位杂交技术检测其基因定位,通过免疫印迹和免疫荧光染色实验对OGT和O-GlcNAc糖基化在组织中的表达及定位情况进行研究;5.采用显微注射方法给斑马鱼尾鳍注射OGT,OGA的抑制剂以及O-GlcNAc糖基化的反应底物Glucose来进行体内实验,改变O-GlcNAc糖基化水平,观察其对尾鳍再生的影响。结果:1.斑马鱼尾鳍再生过程中糖蛋白糖链谱的表达研究:将Ctrl、0.5dpa、ldpa、2dpa、4dpa和6dpa组织蛋白通过凝集素芯片的筛选,有8种凝集素(WGA、STL、DSA、ConA、BS-I、UEA-I、EEL、PHA-E+L)特异识别的糖链结构表达上调;另外8种凝集素(MAL-Ⅱ、SNA、NPA、SBA、MPL、RCA120、PTL-Ⅱ、LTL)特异识别的糖链结构表达下调;其中WGA识别的O-GlcNAc在再生阶段所有的时间点都表达显著上调;凝集素组化验证,不同凝集素识别的糖链在尾鳍组织中表达分布情况不同,部分集中表达于表皮细胞(DSA),部分集中表达于成骨细胞(EEL),表达趋势与凝集素芯片结果基本一致;经凝集素印迹验证,WGA识别的多聚唾液酸、O-GlcNAc结构在再生过程中表达上调,MAL-Ⅱ识别的α-2,3唾液酸糖链在再生过程中表达下调,与凝集素芯片结果一致。2.MALDI-TOF-MS鉴定斑马鱼尾鳍再生过程中组织蛋白的N-及O-糖链结构:通过 MALDI-TOF-MS 在 Ctrl、0.5dpa、1dpa、2dpa、4dpa 和 6dpa 各组中分别鉴定到了 13、17、22、11、18、20种N-糖链。5种N-糖链在6组样本中都可以鉴定到(如:m/z 1345.401,m/z 1972.937,m/z 2458.539),1种糖链在再生阶段5个时间点的样本中鉴定到(m/z1211.868),在Ctrl、0.5dpa、2dpa、4dpa和6dpa组中特定鉴定到的N-糖链分别有 3、8、3、5、7 种;通过 MALDI-TOF-MS 分别在 Ctrl、0.5dpa、1dpa、2dpa、4dpa和6dpa各组中鉴定到了 29、37、32、31、51和51种O-糖链。共有8种O-糖链在6组样本中均被鉴定到(如:m/z 584.442,m/z643.508,m/z 868.700),仅有1种O-糖链在再生不同时间点1dpa-6dpa组中被共同鉴定到(m/z 651.473),在Ctrl、0.5dpa、1dpa、4dpa和6dpa组中特定鉴定到的O-糖链分别有2、9、9、16、11种。3.化学酶标签法标记O-GlcNAc糖蛋白的分离及LC-MS/MS鉴定:经LC-MS/MS鉴定,在 Ctrl、0.5dpa、1dpa、2dpa、4dpa、6dpa 分别有 1595、1525、1445、1892、1678、1778个O-GlcNAc糖蛋白被鉴定并进行GO注释;有784种蛋白共同存在6个时间点中,同时每个时间点都有各自被特异鉴定到的;经过WEGO功能注释,发现被鉴定到的蛋白在细胞组分、分子功能、生物过程中大部分都相同,有一些具有差异,如:抗氧化活性功能、节律过程等,在再生时间点参与的基因数量有差异;通过Funrich对O-GlcNAc糖蛋白进行GO富集发现,在4dpa时参与尾鳍再生生物过程的基因富集程度很高,并且数量也较多,有较多O-GlcNAc糖蛋白参与调控尾鳍的再生过程,在干细胞分化、TGF-β受体信号通路、组织重塑、尾鳍再生等生物过程中,参与的基因数量与再生时间点明显相关,将参与这些生物过程的蛋白筛选出来,进行KEGG pathway分析,发现其中有13种蛋白共同参与了剪接体通路,26种蛋白之间存在密切的相互作用网络,实验结果说明O-GlcNAc糖蛋白确实参与尾鳍再生的调控。4.斑马鱼尾鳍再生过程中O-GlcNAc糖基化相关糖酶的基因及蛋白表达水平分析:通过qRT-PCR分析ogt和oga基因在尾鳍再生过程中转录水平的结果,发现两个基因的表达趋势相似,与对照组Ctrl相比,均在再生过程中1dpa、2dpa、4dpa、6dpa这几个时间点表达上调,在1dpa-2dpa时,表达上调最为明显,在2dpa时达到峰值;原位杂交与qRT-PCR的结果基本一致,再生过程中,ogt和oga在芽基处聚集表达;通过免疫印迹可知OGT在再生过程中表达上调,4dpa时,达到峰值;O-GlcNAc糖基化水平在尾鳍再生过程中的变化趋势同OGT的变化是相似的;通过免疫荧光染色对OGT在尾鳍组织中的表达分布情况进行研究发现,在再生过程中,OGT表达逐渐增多,并且在1dpa和2dpa时非常明显地聚集在再生芽基顶端,表达强烈;O-GlcNAc糖基化水平的表达趋势与OGT相似,O-GlcNAc修饰的蛋白主要分布在表皮细胞和结缔组织细胞的细胞质和细胞膜上。5.O-GlcNAc糖基化对斑马鱼尾鳍再生过程的影响:当用Alloxan或OSMI-1抑制OGT的活性时,组织中O-GlcNAc糖基化水平下降,尾鳍再生延迟、再生过程被抑制;当用Thiamet-G抑制OGA的活性时,组织中O-GlcNAc糖基化水平升高,再生过程被促进、尾鳍再生加快;当提供更多的O-GlcNAc糖基化底物葡萄糖时,组织中O-GlcNAc糖基化水平升高,再生过程被促进、尾鳍再生加快。结论:以上研究结果表明,在斑马鱼尾鳍再生的过程中,各个时间点的糖链结构差异明显,其组织蛋白的多种糖基化修饰发生显著变化,其中O-GlcNAc糖链表达变化尤为显著。O-GlcNAc糖蛋白在斑马鱼尾鳍再生过程中发挥重要作用,参与了多项对尾鳍再生的调节,其中OGT通过上调斑马鱼尾鳍再生过程中O-GlcNAc糖基化水平促进尾鳍再生。