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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种原发于肝脏的恶性肿瘤,是最常见的消化系统恶性肿瘤,在全球恶性肿瘤最常见死亡原因中位居第四位。慢性乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒感染,暴露于黄曲霉毒素和其他危险因素有助于HCC的发展。HCC具有起病隐匿,早期不易诊断,恶性程度高,预后差,进展快等特点,仅10-20%的HCC患者适合外科治疗,因此为HCC的诊断、预后和治疗寻找一种新的有效的标志物显得十分重要。microRNAs(miRNAs)是一类小的、进化高度保守的、内源性的、单链的、非编码的RNA分子,长度大约为21-24个核苷酸,调节转录后基因的表达。它们在许多重要的生物学进程包括细胞周期、分化、发育和新陈代谢方面发挥了重要的作用。miRNAs既可以作为抑癌因子,又可以作为促癌因子发挥作用,它们的这种双重作用促使很多研究人员在miRNAs和肿瘤方面进行研究。越来越多的证据表明,一些特定的miRNAs在HCC中表达异常,并且与HCC的发生、发展密切相关。近期研究表明有17个miRNAs在肝细胞癌中是高表达的,包括miR-181,miR-182,miR-183,miR-224,miR-21,miR-222,miR-96,miR-9,miR-216,miR-324-5p,miR-186,miR-155,miR-301,miR-221,miR-151,miR-374和miR-106b。另外,有9个miRNAs在肝细胞癌中低表达的,它们分别是:miR-139,miR-214,miR-199a-3p,miR-199a-5p,miR-125a,miR-195,miR-34a,miR-200a,miR-122a。microRNA-29a(miR-29a),目前人类最感兴趣的miRNAs家族的一员,研究证实,miR-29a在很多不同类型的肿瘤中如前列腺癌、肾细胞癌、胃癌和胰腺癌是不表达或者是表达下调的,然而miR-29a在HCC中的作用还不清楚。基于上述研究,我们推测,miR-29a可能在HCC的发生发展中起到一定作用。为此我们利用Realtime PCR对肝癌细胞系和临床HCC患者标本miR-29a的表达情况进行检测。结果提示,miR-29a在肝癌细胞系和HCC患者标本中的表达均呈下降趋势,表明miR-29a在HCC的发生发展中起到重要的作用。本次实验研究首先在人的不同肝癌细胞系、HCC患者和相应癌旁组织检测miR-29a的表达,研究miR-29a的表达水平与HCC患者生存时间的关系;利用体内外实验,分别检测了miR-29a对肝癌细胞HepG2增殖及迁移能力的影响;利用Realtime PCR和Western Blot方法对预测的靶基因胰岛素样生长因子1受体进行初步鉴定。内容主要分为三个部分。第一部分miR-29a在人肝癌细胞系及肝癌患者标本中的表达及其与HCC的预后我们首先利用Realtime PCR分别检测了人的不同的肝癌细胞系及62例临床HCC患者标本中miR-29a的表达水平,同时对miR-29a表达水平与肝癌患者生存时间进行分析。结果表明,与正常肝细胞chang liver、LO2相比,miR-29a在肝癌细胞HepG2、Huh7、MHCC7721和Hep3B中表达下调。62例肝癌患者癌肿组织标本miR-29a的表达水平与对应的癌旁组织相比下调,miR-29a表达水平与肝癌患者生存时间长短密切相关。表明miR-29a参与HCC的发生发展过程。第二部分miR-29a在肝癌细胞HepG2中的生物学功能了解miRNAs的生物学功能为研究HCC主要肿瘤相关机制提供新手段,因此为明确miR-29a在肝癌细胞中的生物学功能,我们在体外用miR-29a模拟物(mimic)转染HepG2细胞,通过CCK8实验、软琼脂克隆形成实验、划痕实验、流式细胞术、Transwell迁移实验和裸鼠成瘤等检测其对HepG2细胞功能影响。实验结果发现,CCK8实验、软琼脂克隆形成实验与对照组相比,HepG2细胞转染miR-29a mimics后,其增殖的能力明显减低;流式细胞仪检测发现,miR-29a对HepG2细胞凋亡无影响,它可导致HepG2细胞周期的G1期阻滞;划痕实验及Transwell迁移实验结果发现,miR-29a能抑制HepG2细胞的迁移;转染miR-29a mimics的HepG2细胞种植在BALB/c裸鼠皮下,结果与对照组相比,成瘤能力明显受到抑制。本部分结果表明miR-29a能抑制HepG2细胞的增殖,不是通过诱导其凋亡实现的,而是通过引起HepG2细胞在细胞周期G1期发生阻滞,同时miR-29a能抑制HepG2细胞迁移,提示miR-29a可能对肝癌的发生及发展起到重要作用。第三部分miR-29a靶基因预测及初步鉴定前两部分结果表明miR-29a参与HCC的发生发展过程,为了进一步研究miR-29a抑制HepG2细胞增殖及迁移的机制,我们对其靶基因进行了初步鉴定。我们利用生物信息学的方法对miR-29a的靶基因进行了初步预测,选择出miR-29a功能相关的可能靶基因。初步明确胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)为miR-29a的靶基因。通过免疫组化及western Blot初步验证了miR-29a能作用于IGF1R抑制其表达。同时我们还利用了siRNA技术证明抑制IGF1R的表达,可明显抑制HepG2细胞的增殖及迁移能力。结果表明,IGF1R是miR-29a的靶基因,miR-29a可能是通过调节IGF1R的表达发挥其抑制HepG2细胞的增殖及迁移作用。本研究表明,miR-29a可能对肝细胞的增殖具有负性调节作用,其表达下调与HCC的发生发展密切相关,同时miR-29a可靶向抑制IGF1R的表达,从而抑制HCC的发展。miR-29a可以作为HCC的一个新的分子标志物,为HCC的诊断、预后和治疗提供新思路。