目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病主要的微血管并发症之一，在西方国家已成为导致终末期肾衰的首要原因，在我国其发病率和在慢性透析性肾病中所占的比例也在不断增加。探讨其发病机制、寻求有效的防治措施对广大DN患者具有重要意义。DN的发病机制十分复杂，涉及到糖脂代谢紊乱、血流动力学异常、炎症介质释放、细胞因子、氧化应激以及细胞凋亡等多因素的作用。近年来，随着足细胞系的建立及生化技术的发展，对足细胞的认识和研究逐渐深入，足细胞损伤在DN发病中的作用得到认同，被认为是引起DN蛋白尿和肾小球硬化的关键因素，这为DN的预防和治疗带来了新的契机。足细胞又称为脏层肾小球上皮细胞，与内皮细胞、肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）共同构成肾小球滤过屏障。早期损伤形态学表现为足突融合和消失，并逐渐出现足细胞体积变小、阴电荷减少，直至足细胞从GBM上脱落随尿液排出。足细胞是高度分化的细胞，增生能力差，当从GBM上脱落的速度超过了其代偿能力时，破坏了滤过膜的完整性，从而形成大量蛋白尿。同时足细胞不断受到刺激，分泌细胞外基质如Ⅳ型胶原（collogenⅣ，Col Ⅳ）增多，最终引起肾小球硬化。高糖、血管紧张素Ⅱ、脂质代谢紊乱、氧化应激、炎症因子等均可刺激足细胞，引起足细胞功能失调，导致足细胞损伤。新近研究表明足细胞的功能异常与本身表达的特异性结构蛋白发生突变或缺失有关。有关足细胞结构蛋白研究较多的是裂孔膜蛋白，它们组成裂孔膜复合体共同维持着裂孔膜的完整性。近年来足盂蛋白（podocalyxin, PCX）在多种肾脏疾病足细胞损伤中的作用受到重视，它是足突顶膜区的成熟标志，是足细胞上主要带电荷的结构蛋白，也是组成肾小球滤过膜电荷屏障的主要物质之一，当肾组织表达减少或尿中表达增多可提示早期足细胞损伤。结蛋白（desmin）是一种细胞骨架中间丝蛋白，与α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscle actin, α-SMA）一样属于肌源性细胞标志，正常情况下仅在系膜细胞少量表达，足细胞不表达，当足细胞受损发生表型改变时，可大量表达，因此也可作为反映足细胞损伤的标志。磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3kinese/protein kinaseB, PI3K/Akt)信号通路参与细胞分化、增殖、凋亡以及迁徙等，其过度激活导致细胞功能失调。LY294002通过靶向抑制PI3K的催化亚基p110，阻碍PI3K的活化，从而抑制其下游靶分子PDK和Akt的活化，成为研究PI3K-Akt通路最经典的抑制剂。第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因（phosphase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN），具有特异磷酸酯酶的活性，是PI3K/Akt通路的负调控基因，通过使在3’羧基位脱磷酸生成PIP2，拮抗PI3K的作用，实现对PI3K/Akt通路的负调控。研究表明, PI3K/Akt通路参与了DN小管上皮细胞转分化、系膜细胞增生肥大等，我科最新的研究也证实了该通路参与了高糖刺激的肾小管上皮细胞脂质代谢和细胞外基质的产生，然而该通路在糖尿病肾病足细胞损伤方面的研究却鲜见报道，尤其未见DN患者方面的相关报道。本研究拟通过观察DN患者及体外高糖刺激的小鼠足细胞中PI3K/Akt通路的激活和足细胞结构蛋白的表达变化，并进一步应用LY294002干预或PTEN基因转染足细胞，探讨PI3K/Akt通路对足细胞结构蛋白表达改变的影响，以证明PI3K/Akt通路在DN足细胞损伤中是否发挥作用，为糖尿病肾病的防治提供新的干预靶点。方法：1糖尿病肾病患者病例选择及PCX、Col Ⅳ、desmin、p-Akt、PTEN的检测选择2009年10月至2011年10月期间在河北医科大学第二医院肾内科住院，经病史、临床检查及肾活检病理诊断为糖尿病肾病的患者30例，年龄51.5±15.7岁，男16例，女14例（男：女=8:7），除外乙肝病毒相关性肾炎、狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、淀粉样变性、骨髓瘤肾病等继发性肾脏病患者，除外合并膜性肾病、局灶阶段性肾小球硬化、IgA肾病等原发性肾脏病的患者。根据根据2010年美国肾脏病理学会糖尿病肾病分级标准将所有患者分为3组：Ⅰ级病变组9例，Ⅱ级病变组10例，Ⅲ级病变组11例。详细记录每位患者肾活检前的临床资料。肾活检日清晨留取新鲜尿标本，离心取上清液，ELISA方法检测尿PCX的含量，10例血糖、肾功能及尿检正常的健康志愿者尿标本作为对照。免疫组织化学检测肾小球组织内ColⅣ、desmin、p-Akt、PTEN蛋白的表达，10例肾肿瘤患者远端肾穿组织经病理证实为正常组织的标本作为对照。2足细胞培养以及高糖刺激和LY294002干预后p-Akt、Akt、PTEN、podocalyxin、nephrin、desmin、α-SMA的检测将复苏的小鼠足细胞在33℃、含10u/mlγ-干扰素、双抗、10%胎牛血清的DMEM-F12完全培养液培养传代后，转入37℃、含双抗、10%胎牛血清、不含γ-干扰素的DMEM-F12培养液中进行诱导分化，10~14天后用不含血清的培养液同步24h，予以高糖（浓度30mmol/L）刺激，培养0，3，6，12，24，48h后收集细胞,同时以正常糖浓度（浓度5mmol/L）培养相同时间作为对照组。然后给予不同浓度的LY294002的干预，分组如下： I组:正常糖对照组； II组:高糖组； III~Ⅴ组:高糖+LY294002干预组（LY294002浓度分别为10、20、40μmol/L），以p-Akt表达的高峰时间段作为干预时间。采用免疫细胞化学检测p-Akt、Akt、PTEN、PCX、desmin的表达，Western blot检测p-Akt、Akt、PTEN、PCX、nephrin、desmin、α-SMA蛋白的表达，Real time-PCR检测PCX和desmin mRNA的表达。3体外PTEN基因转染以及p-Akt、Akt、PTEN、PCX、nephrin、desmin、α-SMA的检测应用Lipofectamine2000转染试剂将pcDNA-PTEN-EGFP真核表达载体转染至小鼠足细胞，并将实验细胞分为4组：①正常糖对照组（NG）②高糖刺激组（HG）③空载体组（空载体转染后给予高糖刺激，HG controlvector）④PTEN转染组（PTEN基因转染后给予高糖刺激，HG PTENvector）。48h后倒置荧光显微镜观察荧光蛋白的表达，计算转染效率。收集细胞提取细胞总蛋白、核蛋白、RNA，Western blot检测p-Akt、Akt、PTEN、PCX、nephrin、desmin、α-SMA蛋白的表达，Real time-PCR检测PTEN、PCX和desmin mRNA的表达。结果：1糖尿病肾病患者临床病理表现、PCX的含量及ColⅣ、desmin、p-Akt、PTEN的表达①肾小球形态学观察： DNⅠ级病变组患者肾小球体积增大，基底膜轻度弥漫性增厚，系膜区未见明显病变；Ⅱ级病变组患者基底膜弥漫均匀增厚，系膜细胞及系膜基质增生，系膜区扩大，未见K-W结节形成；Ⅲ级病变组患者系膜细胞及系膜基质中、重度增生，可见K-W结节，但球性硬化比例未超过50%。电镜下肾小球基底膜均质性增厚，足突融合、消失。②免疫组化结果：与对照组相比，DN患者肾小球内ColⅣ和desmin表达增强，随肾小球病变加重，其表达逐渐增强。ColⅣ在系膜区和基底膜表达，desmin以系膜区表达明显。对照组肾小球内未见p-Akt表达，DN时肾小球内表达增强，其中Ⅱ级病变时最明显，Ⅲ级病变时表达反而减弱；对照组肾小球内偶见PTEN表达，DNⅠ级病变时PTEN表达最明显，以后随病变加重表达逐渐减弱。p-Akt在细胞核及细胞浆中均有表达，而PTEN主要表达在细胞浆中。③尿中PCX的含量：DN患者尿PCX的含量明显高于健康对照组（t=27.149, P=0.000）；且随肾病变的加重，尿PCX的含量逐渐升高（P均＜0.05）。④尿PCX含量与上述指标的相关性：DN患者尿PCX水平与24h尿蛋白排泄量、血肌酐、糖化血红蛋白、肾小球内ColⅣ及desmin的表达呈正相关，与血浆白蛋白、估算的肾小球滤过率、肾小球内PTEN的表达呈负相关（P均<0.01）。2高糖刺激和LY294002干预对足细胞内PI3K/Akt通路及足细胞标志蛋白表达的影响①p-Akt、Akt、PTEN蛋白的表达：免疫细胞化学显示，p-Akt表达于细胞核及细胞浆，Akt、PTEN则表达在细胞浆。Western-blot结果表明，随高糖刺激时间延长，p-Akt表达逐渐增强，48h达高峰（P<0.01）；Akt的表达无明显变化（P＞0.05）；PTEN的表达在高糖刺激3h达高峰，随后逐渐减弱，至24h后低于高糖刺激前，48h降至最低水平（P<0.01）。给予LY294002干预后，随LY294002浓度的增加，p-Akt表达逐渐减弱，但仍高于正常糖对照组（P<0.01）；Akt的表达则无明显改变（P＞0.05）。②PCX、desmin蛋白及mRNA的表达：免疫细胞化学显示，PCX表达在胞膜和胞浆中，desmin表达在胞浆中。随高糖刺激时间延长，PCX蛋白表达及mRNA水平逐渐减弱，48h降至最低水平（P<0.05），而desmin蛋白表达及mRNA水平则逐渐增强，48h达到最高峰（P<0.05），足细胞表型发生了变化。LY294002干预后，以浓度依赖的方式抑制了高糖诱导的PCX蛋白及mRNA的表达下调、desmin蛋白及mRNA的表达上调，但与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），表明LY294002可以改善高糖诱导的足细胞表型改变。③Western-blot结果显示，随高糖刺激时间延长，nephrin表达逐渐减弱，α-SMA表达逐渐增强，在48h时nephrin表达最弱、α-SMA表达最强（P<0.01）。给予LY294002处理后，随LY294002浓度的增加，对高糖诱导的nephrin表达下降和α-SMA表达升高的抑制作用逐渐增强，但nephrin仍低于、α-SMA仍高于对照组（P<0.05）。3PTEN高表达对高糖诱导的足细胞内PI3K/Akt通路及足细胞表型改变的影响①转染组PTEN蛋白及mRNA表达明显高于高糖组、空载体组和对照组（P<0.05）。PTEN基因成功导入足细胞，并在蛋白水平上获得高效表达。空载体组PTEN蛋白及mRNA表达明显低于对照组（P<0.05），但与高糖组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。②Western blot检测结果显示，PTEN基因转染组p-Akt的表达明显低于高糖组和空载体组（P<0.01），与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。各组细胞Akt表达没有明显差异。PTEN基因转染组PCX、nephrin表达明显高于高糖组和空载体组，但仍低于对照组（P<0.05）。相反PTEN基因转染组中desmin、α-SMA表达明显低于高糖组和空载体组，但仍高于对照组（P<0.05）。③Real time-PCR检测结果显示，PTEN基因转染组PCX mRNA水平高于高糖组与空载体组，但仍低于对照组（P<0.05）。PTEN基因转染组desmin mRNA水平低于高糖组和空载体组，但仍高于对照组（P<0.05）。结论：1DN患者存在足细胞损伤和PI3K/Akt通路激活，尿中PCX的水平可以反映病情的严重程度；并与p-Akt、PTEN的表达相关，提示PI3K/Akt通路可能参与了DN足细胞损伤。2高糖以时间依赖的方式刺激足细胞内p-Akt表达增强、足细胞标志蛋白（PCX、nephrin）表达下调、肌源性细胞标志蛋白（desmin、α-SMA）表达上调。特异性PI3K/Akt通路阻断剂LY294002以浓度依赖的方式抑制p-Akt生成，并可改善上述足细胞表型的改变，提示高糖通过激活PI3K/Akt通路介导足细胞表型改变，引起足细胞损伤。3PTEN高表达可以抑制Akt的活化、改善足细胞表型的变化，提示PTEN通过负调控PI3K/Akt通路可以减轻足细胞损伤，为DN的防治提供了新的策略手段。