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目的:以两个独立的队列,70例新鲜冰冻肝细胞癌组织样本和148例临床病例资料及随访资料完整的肝细胞癌组织芯片为基础,研究HO-1在肝癌组织中的表达情况与肝癌恶性程度的关系,并探讨HO-1的表达与肝癌患者临床病理因数及手术预后的关系。方法:(1)队列1:肝细胞癌组织70例,来自于同济医院转化医学中心标本库,均已经通过病理报告和B超检查明确诊断无误。全部标本是原发性肝癌患者手术切除后的肝细胞癌组织。肿瘤组织离体后立刻-80摄氏度低温保存,用于实时荧光定量PCR反应检测和western-blot检测。(2)队列2:148例肝癌组织芯片,来自于同济医院转化医学中心标本库,均已经通过病理报告和B超检查明确诊断无误。全部标本是原发性肝癌患者手术切除后的肝细胞癌组织。组织芯片用于免疫组织化学染色检测,结合病例资料及预后随访信息后,分析HO-1的表达与肝癌患者临床病理特征及术后预后的关系。结果:(1)根据HO-1在不同肝癌临床分期的癌组织中的表达情况统计分析:HO-1在肝癌临床期BCLC-C期的病人的癌组织中的m RNA水平和蛋白水平的表达量高于肝癌临床期BCLC-A或者B期的病人。(2)根据组织芯片各点染色评分,结合临床资料分析:同样的,与肝癌临床分期巴塞罗那分期(BCLC)早期的病人相比较,巴塞罗那分期(BCLC)晚期病人的癌组织样本中的HO-1呈现升高趋势。另外,HO-1表达与肿瘤的包膜不完整性,肿瘤的血管侵犯,肿瘤的TNM分期,肿瘤的BCLC分级,这些肿瘤恶性程度有关的临床病理因素呈正相关。生存分析显示:肿瘤组织中高表达HO-1的患者组,无瘤生存时间和总体的生存时间显著低于肿瘤组织中低表达HO-1的患者组。结论:HO-1在肝癌临床分级晚期的病人的癌组织中表达高于早期的的病人,另外癌组织中HO-1高表达的肝癌病人预后较差,提示HO-1可能和肝癌的侵袭转移相关。目的:这部分工作以具有不同侵袭力的肝癌细胞为工具,成功构建HO-1敲除/敲减的肝癌细胞系和过表达HO-1肝癌细胞系,通过一系列体内外功能学实验来研究HO-1对肝癌细胞肿瘤生物学行为的影响,探讨HO-1在肝癌进展中的作用。方法:(1)Western-Blot检测比较HO-1在不同转移潜能肝癌细胞系中的表达差异,以验证HO-1在高侵袭性的肝细胞癌细胞系内表达上调,同时为下一步的实验挑选合适的细胞系。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术手段构建HO-1基因组上稳定敲除的细胞系,同时利用慢病毒载体为工具构建HO-1稳定敲减的肝癌细胞系,利用逆转录病毒载体为工具构建HO-1过表达的肝癌细胞系。CCK-8实验,平板克隆实验检测细胞增殖能力。用裸鼠皮下成瘤模型评定肿瘤体内成瘤能力。(2)Transwell细胞迁移和侵袭实验检测HO-1对肝癌细胞迁移或者侵袭能力的影响。通过尾静脉注射肝癌细胞肺转移模型,小动物活体成像技术,HE染色评定HO-1对肝癌细胞肺转移能力的影响。结果:(1)HO-1在具有高侵袭转移能力的肝癌细胞系中(Bel7402,MHCC-97L,MHCC-97H,和HCC-LM3)高表达,而在低侵袭转移能力的肝癌细胞系中相对的低表达。敲除HO-1和敲减HO-1后都表现出抑制肝癌细胞的体外增殖能力和皮下成瘤能力,而过表达HO-1能增强肝癌细胞的体外增殖能力和皮下成瘤能力。流式细胞检测显示在肝癌细胞敲除HO-1和敲减HO-1后增加处于G1的细胞量,减少处于S期的细胞量,引起肿瘤细胞的G1期阻滞,而过表达HO-1能够正向调控细胞周期。(2)敲除和敲减HO-1后都变现出明显减弱肝癌细胞的体外迁移能力、侵袭能力,而过表达HO-1能够增强肝癌细胞的体外迁移能力、侵袭能力。尾静脉注射肝癌细胞肺转移模型结果显示敲除或者敲减HO-1后明显减弱肝癌肺转移的能力,而过表达HO-1能够增强肝癌细胞肺转移的能力。结论:HO-1能够促进肝癌细胞的增殖、肿瘤形成、迁移、侵袭、肺转移。目的:为了探讨HO-1在肝癌中调控肝癌恶性生物学行为的机制,我们以HO-1为诱饵应用免疫共沉淀和质谱联用的方法筛选其相互作用的蛋白。目的在于在发现可能影响或辅助HO-1功能发挥的新分子。结果我们筛选到了与HO-1相互作用的蛋白14-3-3ζ,本部分将围绕4-3-3和HO-1相互作用调控肝癌细胞恶性进展的机制研究为主旨,通过以下三节来介绍:第一节(1)14-3-3ζ与HO-1相互作用的验证。第二节(2)14-3-3ζ可以通过抑制HO-1的泛素化降解来维持其蛋白稳定性。第三节(3)HO-1参与了14-3-3ζ介导的肝癌细胞增殖与侵袭。方法:第一节(1):免疫共沉淀和质谱联用去筛选可能与HO-1相互作用的蛋白。质谱结果分析,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co IP),去验证是否外源性或者内源性的HO-1都能与14-3-3ζ相互作用,以及判断14-3-3家族的其他成员是否也能与HO-1相互作用。免疫荧光共聚焦验证HO-1与14-3-3ζ在细胞内存在共定位。构建一系列HO-1的截短和点突变的质粒,通过免疫共沉淀实验,确定HO-1的与14-3-3ζ相互作用的结构区域。第二节(2):用Western blotting,RT-PCR验证敲减14-3-3ζ后能够降低HO-1的蛋白水平量,而对HO-1的m RNA表达水平没有影响。用CHX蛋白降解实验和MG132处理细胞实验等验证敲减14-3-3ζ后能够促进HO-1蛋白水平的降解。用体内泛素化降解实验证敲减14-3-3ζ后能够导致HO-1的泛素化降解水平增加。第三节(3):通过Western blotting,CCK8增殖实验,平板克隆实验,体内成瘤实验,transwell迁移侵袭实验等证明在HO-1过表达的稳定肝癌细胞系里敲减14-3-3ζ能够逆转HO-1促进的增殖、迁移、侵袭效应。同样的,通过Western blotting,CCK8增殖实验,平板克隆实验,transwell迁移侵袭实验验证在14-3-3ζ过表达的稳定肝癌细胞系里利用si RNA干扰HO-1表达后能够废除掉14-3-3ζ促进的增殖、迁移、侵袭效应。结果:(1)质谱结果分析,免疫共沉淀结果证实HO-1能够和14-3-3家族的多个成员相互作用,其中14-3-3ζ亚型结合比较紧密。免疫荧光共聚焦证实了不管是外源性的和内源性表达的HO-1与14-3-3ζ在肝癌细胞体内存在共定位关系。构建一系列HO-1的截断和点突变的质粒,和免疫共沉淀实验我们发现了HO-1蛋白其C端的265-288氨基酸区域与14-3-3ζ相互作用。(2)Western blotting,RT-PCR验证了敲减14-3-3ζ后能够降低HO-1的蛋白水平量,而对HO-1的m RNA表达水平没有影响,提示了14-3-3ζ可能影响了HO-1的蛋白降解过程。CHX蛋白降解实验和MG132处理细胞实验等验证了14-3-3ζ后能够促进HO-1蛋白水平的降解。体内泛素化降解实验证敲减14-3-3ζ后能够导致HO-1的泛素化降解水平增加。(3)HO-1过表达的稳定肝癌细胞系里敲减14-3-3ζ能够逆转HO-1促进的增殖、迁移、侵袭效应。在14-3-3ζ过表达的稳定肝癌细胞系里利用si RNA干扰HO-1表达后能够废除掉14-3-3ζ促进的增殖、迁移、侵袭效应。结论:(1)14-3-3ζ与HO-1相互作用。(2)14-3-3ζ可以通过抑制HO-1的泛素化降解来维持其蛋白稳定性。(3)HO-1参与了14-3-3ζ介导的肝癌细胞增殖与侵袭。提示14-3-3ζ通过相互作用抑制HO-1的泛素化降解,增加其蛋白水平的稳定性,调控促进肝癌细胞的生长与转移。14-3-3ζ和HO-1相互作用共同调控肝癌细胞恶性进展。