论文部分内容阅读
目的:构建大鼠抗小鼠CD40单链抗体(single chain Fragment variable,Sc Fv)的噬菌体展示文库并对文库进行库容及多样性分析,进而筛选出高亲和力的激动型抗体。方法:(1)将乳化成功的小鼠重组CD40蛋白沿脊柱两侧皮肤皮下注射免疫Lewis大鼠(2)多次免疫Lewis大鼠,解剖并游离脾脏提取总RNA,采用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术获得大鼠抗小鼠CD40抗体的重链可变区(Heavy Variable,VH)及轻链可变区(Light Variable,VL)的DNA片段(3)采用重叠延伸拼接PCR法(splicing by overlap extension PCR SOE-PCR)将抗体可变区的重链和轻链拼接成Sc Fv(4)通过限制性内切酶酶切及定向克隆技术将Sc Fv插入噬菌粒p CANTAB5E,构建重组噬菌粒p CANTAB5E-Sc Fv(5)将重组噬菌粒转化TG1感受态细胞,构建原核表达文库。(6)使用M13KO7辅助噬菌体侵染TG1文库,抗小鼠CD40单链抗体的噬菌体展示文库构建完成。(7)梯度稀释噬菌体抗体库,进行噬菌斑形成实验,计算抗体库容量,并随机挑选阳性克隆,分析噬菌体文库多样性。(8)对构建的噬菌体库扩增,并把小鼠CD40蛋白作为靶抗原利用微孔板筛选法筛选噬菌体抗体库,经“吸附-洗脱-扩增”步骤进行几轮筛选并进行测序分析。结果:(1)RT-PCR扩增免疫大鼠体内抗小鼠CD40抗体的VH、VL片段。(2)重叠延伸拼接PCR将抗体可变区重链和轻链拼接成Sc Fv,经基因测序可知VH、VL片段连接位置合适,琼脂糖凝胶电泳检测Sc Fv碱基大小约740bp,电泳条带清晰,亮度较好,Sc Fv拼接正确。(3)构建的重组质粒p CANTAB5E-Sc Fv经限制性内切酶双酶切处理(Sfi I及Not I),凝胶电泳结果显示两条条带分别位于740bp、4200bp左右位置,表明Sc Fv插入p CANTAB5E载体片段大小及位置正确,重组噬菌粒构建成功。(4)使用辅助噬菌体M13KO7侵染重组质粒TG1,抗小鼠CD40单链抗体的噬菌体文库构建完成,铺平板鉴定噬菌体文库库容量约为1.2×107pfu/ml,噬菌体滴度1012。(5)随机选择18个阳性单克隆扩增后测序分析,其中13个阳性克隆插入序列的大小及位置正确,测序结果经IMGT软件分析显示重叠拼接的Sc Fv序列与大鼠抗体的基因结构匹配度较高,将任意两个序列互相比对评价文库多样性,比对结果未见完全相同的序列。(6)利用小鼠CD40蛋白作为靶抗原,按照104的筛选压力对噬菌体库进行2轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选。2轮阳性克隆的测序结果进行多重比对,相互之间差异性降低,序列出现收敛现象,不过仍需进一步筛选,从而获得高亲和力抗体。结论:(1)成功构建大鼠抗小鼠CD40单链抗体的噬菌体展示文库。(2)文库库容及多样性评估显示,本研究所构建的噬菌体文库原始库容及多样性较好,符合后续抗体筛选实验要求,进一步可筛选出展示高亲和力大鼠抗小鼠CD40的激动型抗体的目的噬菌体。(3)随着筛选强度的增大,洗脱回收的重组噬菌体数量减少,测序结果中序列出现收敛现象,说明筛选出的重组噬菌体所展示的抗体亲和力不断提高,并且也证明了抗体库的筛选策略合适。为后续实验奠定良好的基础。