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生物在进化的过程中,形成了包括离子通道、离子泵和载体等复杂的营养吸收以及转运系统。在前期,学者们已经做了大量工作来了解这些通道蛋白的分子性质和功能。近年来,基于电生理学和异源表达分析的实验证明,植物环核苷酸门控通道(cyclic nucleotide-gated channel,CNGC)的作用是非选择性阳离子通道。植物CNGCs是一个相对较大的基因家族,目前已经在大麦(Hordeum vulgrare)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)等多种植物中发现了CNGC,但对于CNGCs的功能尚不完全清楚。CNGC2作为植物CNGCs基因家族中第Ⅳ家族B亚组的成员,目前尚缺乏对该蛋白胞吞过程的研究,对于其是否参与植物抗病还需要进一步的探讨。本研究在克隆了拟南芥CNGC2基因,构建35S::AtCNGC2-GFP融合表达载体的基础上,取得了 CNGC2-GFP转基因拟南芥植株。通过可变角度全内反射荧光显微(variable angle-total internal reflection fluorescence microscopy,VA-TIRFM),荧光寿命和荧光共振能量转移(fluorescence lifetime imaging,and Forster resonance energy transfer,FLIM-FRET),荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS)以及荧光互相关光谱(fluorescencecoss-correlationspectroscopy,FCCS)等技术,结合分子生物学的研究方法,对拟南芥CNGC2-GFP在质膜上的分布、运动模式、胞吞以及该蛋白在植物抗病中的作用进行了研究。主要结果如下:(1)胼胝质沉积实验发现,在使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理激活后,与野生型相比,突变体cngc2中出现大量胼胝质的累积。根据该实验结果推测CNGC2与植物抗病相关。(2)运用VA-TIRFM技术,对拟南芥幼苗叶表皮细胞CNGC2动态特征进行了分析,结果发现CNGC2在质膜上分布不均匀,利用MATLAB软件分析后发现,CNGC2存在四种运动模式,其中定向运动为主要运动模式。(3)在使用放线菌酮(cycloheximid,CHX)抑制了胞内新蛋白合成的情况下,用布雷菲德菌素(brefeldin A,BFA)结合FM4-64处理拟南芥幼苗发现,CNGC2-GFP会在胞质内形成BFA小体,说明在静息状态下CNGC2存在组成型胞吞。运用LPS处理后,拟南芥表皮细胞中会出现胞吞小泡,并且通过FCS技术检测发现细胞膜上CNGC2蛋白分子密度减少。说明在激活状态下,活化了的CNGC2蛋白运动加快,CNGC2存在配体诱导型胞吞。(4)抑制剂处理实验表明,Clathrin参与调控CNGC2的胞吞过程。Clathrin抑制剂TyrA23能抑制CNGC2的胞吞和蛋白降解。该结果说明,膜微区介导的蛋白质胞吞途径参与CNGC2的胞吞。应用固醇抽提剂MβCD(methyl-β-cyclodextrin)处理拟南芥幼苗后观察发现,MβCD导致CNGC2-GFP的胞吞受到抑制,暗示富含固醇的膜结构参与了 CNGC2的胞吞。(5)运用非损伤微测技术(non-invasive micro-test technique,NMT),分别对 LPS处理激活后,过表达材料CNGC2、野生型WT以及突变体cngc2中Ca2+流的情况进行检测。随后,分别对野生型以及突变体,在LPS处理后的抗病相关基因的表达情况进行了检测。结果发现:在突变体中分别表现出Ca2+内流量减小以及抗病相关基因表达量上调等现象。此外,结合FCCS技术以及FLIM-FRET技术,可以检测到CNGC2-GFP与CaM-mCherry之间存在相互作用,且在LPS处理后,二者的相互作用增强。以上结果表明CNGC2-GFP参与植物抗病。综上所述,本研究利用高时空分辨率的荧光成像技术,结合分子生物学的研究手段,对CNGC2蛋白的动态特征及胞吞过程进行了分析。研究揭示:CNGC2蛋白在细胞质膜上的运动是高度动态的;CNGC2蛋白存在多种胞吞途径,其中clathrin介导的胞吞途径在CNGC2-GFP的胞吞过程中起到重要作用,并且膜微区也参与了质膜上CNGC2-GFP的胞吞;通过对Ca2+流量、抗病相关基因的表达情况,以及CNGC2蛋白与钙调素蛋白CaM4之间的关系进行的研究表明,CNGC2参与植物抗病。这些结果为进一步揭示CNGC2的胞吞途径,阐明CNGC2参与植物抗病的机制奠定了基础。