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武夷菌素(Wuyiencin)是由不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)产生的一种新型农用抗生素,对多种真菌性病害具有良好的防治效果。采用物理化学诱变的方法选育武夷菌素高产菌株虽然取得了一些进展,但仍不能满足育种和生产上需要。因此,采用分子生物学方法提高武夷菌素效价具有非常重要的意义。本研究构建了武夷菌素产生菌基因组文库,克隆武夷菌素生物合成基因簇并且分析了其功能。此外利用诱变的方法筛选到了武夷菌素生物合成阻断突变株。结果如下:
1.采用pCC1FOS为载体构建了不吸水链霉菌武夷变种基因组文库,文库滴度为8.8×105cfu／ml,文库可覆盖基因组4倍以上。根据同类型抗生素生物合成基因设计特异性引物,最终确定以大环内酯类聚酮合成酶基因设计的引物筛选基因组文库。
2.采用PCR方法对基因组文库进行筛选得到了三个阳性克隆,对阳性克隆酶切后测序最终得到了长度为32509 bp的片段,G+C含量为71.4％,与链霉菌基因组高G+C含量的特征相符。生物信息学分析表明武夷菌素可能是PKSⅠ型抗生素(聚酮类化合物),以模块形式合成。该序列包含5个完整的ORF(开放阅读框),推测orf1编码武夷菌素生物合成起始模块的酮还原酶(KR)和酰基载体蛋白(ACP)；orf2编码合成过程中某一模块的酮合成酶(KS)；orf3长度为27855 bp,为克隆到的最长序列,其编码的蛋白质包含5个聚酮合酶(KS),5个酰基转移酶(AT),5个脱氢酶(DH),五个酮还原酶(KR),1个烯基还原酶(ER)和5个酰基载体蛋白(ACP),构成了合成中的五个模块;orf4编码武夷菌素生物合成中的硫酯酶(TE),参与聚酮长链的环化和水解；orf5为一种转录调控因子,编码的蛋白质属于LuxR蛋白家族,在转录过程起正向调节作用。
3.以武夷菌素产生菌CK-15为出发菌株,通过诱变处理得到一株丧失抑菌活性且性状稳定的突变株N1。突变株孢子丝为长螺旋形,孢子呈椭圆形,与出发菌株相比,在形态上没有显著变化且产孢量无变化。突变株的抑菌谱发生了显著变化,对所有8种供试菌株均无抑制作用。高效液相色谱分析发现突变株中抗生素的特征峰消失。
武夷菌素生物合成基因簇的克隆为今后采用分子生物学方法改造菌株和研究抗生素代谢途径奠定了基础。抗生素生物合成阻断突变株是推断抗生素合成途径的良好材料,武夷菌素生物合成阻断突变株的筛选为抗生素生物合成途径研究提供依据,同时也为武夷菌素生物合成基因功能验证提供了受体。