广西是我国肝癌发生率和死亡率都较高的省份之一,肝癌发病急剧,就诊发现的肝癌往往处于中晚期,临床预后极差。因此,寻找肝癌发生、发展标志物,建立广西肝癌高发区高危人群发生肝癌危险性的预测体系是肝癌防治的重要措施。肝癌的形成是一个多因素、多机制、多基因协同作用的长期复杂过程,是多个基因表达水平改变导致细胞内出现异常分子变化的结果,所以,至今尚未发现较好的肿瘤标志物在高危人群筛检中成为肝癌的预警生物标志物。肿瘤标志物可分为基因标志物和基因表型标志物,以往研究大多为单因素研究模式,一般集中在一个或数个基因和蛋白质,无法全面了解整个基因组多个基因的变化,也不能同时了解多个体液蛋白质的变化,因此,不能全面反映肝癌的分子生物学特征。本研究采用基于广西肝癌高发现场高危人群队列的病例对照研究方法,应用基因芯片技术和蛋白质芯片技术在基因转录水平和蛋白质水平上进行初步筛选,不仅可阐明该地区肝癌发生发展的可能分子生物学机制,同时也为寻找特异性和敏感度都较高的肝癌高危人群预警生物标志物提供依据,同时,也可以阐明该地区肝癌发生发展的分子生物学机制。本研究分以下四个部分进行。第一部分广西肝癌高发区肝癌相关差异表达基因的初步筛选目的:检测广西肝癌高发区肝癌患者和同地区匹配正常人群外周血基因表达谱的差异,对差异表达基因进行分类汇总,通过生物信息学分析,从中挑选候选基因。方法1研究对象:从广西肝癌高发区高危人群队列中选择肝癌病例9例,按照1:1的比例配比,选择同一地区匹配的正常人群9例作为对照组。所有研究对象在知情同意情况下进行问卷调查和采血,采血时未进行手术、放化疗以及生物治疗。2研究方法:采集EDTA抗凝血5ml,提取两组标本的总RNA并纯化mRNA,逆转录合成荧光标记的cDNA探针,与罗氏人表达谱芯片进行杂交,筛选出两组外周血标本的差异表达基因。最后通过Gene Ontology、KEGG和NCBI等数据库分析差异表达基因分子功能、生物过程、细胞组分以及生物学通路,并查阅大量的文献报道,挑选候选基因。结果1肝癌组与对照组外周血之间的基因表达谱存在差异。2在9例肝癌患者外周血中表达情况一致,且与对照组外周血基因表达相比有明显差异的基因有42条,占基因总数的0.93‰,其中上调的基因有20条:上调倍数最大的是GOS2基因,上调倍数为7倍;IGHA1基因上调的倍数为4倍,有两个未知基因的上调倍数在3-4倍,MXD1、IL1R、SLC22A4三个基因的上调倍数在3倍,其余基因的上调倍数都在2倍。下调大于2倍的基因有22条。根据基因参与的生物学过程不同,将这些差异表达基因进行大致分类,发现在上调基因中:与细胞增殖有关的上调基因有 MXD1、IL1R2、IGHAI、TOB1、PROK2 等基因;DUSP1、GOS2、IL8和JUNB、PROK2等基因与细胞周期有关;JUNB与生殖相关;STK17B与凋亡相关;与物质代谢和转运有关的基因有SLC22A4和IRS2; NFIL3和ASGR2与信号传导和转录有关;有LRG1、SLC22A和FLJ36031等3条基因功能不明。下调基因KLRFI、KLRC1和XCL1等基因与信号转导有关;PRF1、GAMA、GAMH和GZMB与免疫应答有关;HOP与细胞分化有关;EDG8、KSP37等5条下调基因的功能不明。3经生物信息学分析,42条差异表达基因涉及到生殖、发育过程、细胞增殖与分化、代谢、生物节律、信号转导、血液循环、血管生成、细胞凋亡、免疫应答、细胞周期、氧化应激、细胞迁移等生物学过程。上调基因的生物学通路多参与细胞增殖、细胞凋亡和细胞因子通路,下调基因多与免疫应答等通路有关。4上调的20条基因中,有3条未知基因,其余17条基因中有12条基因被报道与恶性肿瘤的发生有关。5.对12条与恶性肿瘤发生有关的上调基因再次筛选,结合文献报道,选择PROK2和DUSP1基因作为下一步实验的候选基因。结论:使用基因芯片技术可以一次性、平行的比较不同研究对象外周血的基因表达谱差异。借助这一技术,本研究发现了42条与广西肝癌高发区肝癌发生发展有关的基因,大多数基因与细胞周期调控和信号转导有关,另外尚有部分功能未明的基因。结果提示该地区肝癌的发生发展可能是在环境因素作用下出现多个基因mRNA表达水平改变的结果。对这些差异表达基因进行系统研究将有助于阐明广西肝癌高发区肝癌发生发展的可能机制,寻找和发现高危人群的可能预警生物标志物。第二部分差异表达基因PROK2和DUSP1在广西肝癌高发区肝癌患者外周血中的表达验证目的:从基因芯片结果中挑选出差异基因PROK2和DUSP1,增大各组样本的例数,比较PROK2和DUSP1基因在肝癌组和正常匹配人群外周血中的mRNA表达情况,以验证基因芯片结果的可靠性,并初步探讨这些基因与广西肝癌高发区肝癌之间的关系。方法1研究对象:从广西肝癌高发区高危人群队列中选取肝癌病例25例,按照1:1的比例配比,选择同一地区的匹配正常人25例作为对照组。所有研究对象在采血时未进行手术、放化疗以及生物治疗,并在知情同意情况下进行问卷调查和采血。2研究方法:采集EDTA抗凝血5ml,提取两组标本的总RNA,逆转录为cDNA后,应用荧光定量RT-PCR中的相对定量法检测PROK2和DUSP1基因在两组标本外周血中的mRNA表达情况。将这些基因的表达情况与高发区肝癌患者的流行病学资料结合分析,初步探讨PROK2和DUSP1基因与广西肝癌高发区肝细胞癌之间的关系。结果:肝癌患者外周血PROK2的mRNA表达水平为7.21 ±2.39,对照组PROK2的mRNA表达水平为1.24±0.44,统计学分析两组的PROK2的mRNA表达水平有显著性差异(P<0.01);肝癌患者外周血DUSP1的mRNA表达水平为2.48±0.93,对照组DUSP1的mRNA表达水平为0.83±0.327,统计学分析两组的DUSP1的mRNA表达水平有显著性差异(P<0.01)结论1肝癌组外周血PROK2和DUSP1基因表达上调,说明PROK2和DUSP1基因与广西肝癌高发区肝癌的发生发展相关。2 PROK2基因和DUSP1基因在肝癌的形成过程中发挥了一定的作用,且两个基因均与MAPK信号通路有关,其相互的作用机理有待于进一步研究。3 PROK2基因和DUSP1基因在肝癌组外周血中的表达水平显著升高,有望进入肝癌高发区肝癌预警标志物的进一步筛选研究。4肝癌的发生发展是个复杂的病理过程,其间有大量的基因发生了改变,这些基因之间又可能存在着或多或少的联系,采用以广西肝癌高发现场高危人群队列为基础的病例对照研究方法,对这些基因进行系统研究将有助于阐明该地区肝癌发生机制和寻找高危人群可能的预警生物标志物。5在扩大样本例数以后,荧光定量RT-PCR的研究结果与芯片研究结果基本一致,提示基因芯片是一种可行的研究技术,其研究结果具备一定的可重复性。第三部分广西肝癌高发区肝癌相关差异蛋白的初步筛选目的:检测广西肝癌高发区肝癌患者和同地区匹配正常人群血清生长因子和凋亡因子的差异。方法1研究对象:从广西肝癌高发区高危人群队列中选择肝癌病例11例,按照1:1的比例配比,选择同一地区匹配正常人11例作为对照组。所有研究对象在知情同意情况下进行问卷调查和采血,采血时未进行手术、放化疗以及生物治疗。2研究方法:采集非抗凝血5ml,离心分离血清,稀释后与蛋白质芯片杂交,用激光扫描仪扫描并收集信号图像进行数据分析,筛选出两组标本血清的差异蛋白质。结果:肝癌患者血清IGFBP-2浓度为887.48±225.91pg/ml,对照组血清IGFBP-2浓度为558.17± 125.97pg/ml,两组标本血清IGFBP-2浓度有统计学意义(P<0.05);肝癌患者血清P21相对定量水平为1040.97±395.91,对照组血清P21水平为2756.64±1355.64,两组标本血清P21浓度有统计学意义(P<0.05)。结论1.广西肝癌高发区肝癌患者和同地区匹配正常人群的血清蛋白质存在差异。2.在肝癌患者血清中表达情况一致,且与对照组血清蛋白质相比有较明显差异的蛋白质有2条,分别为IGFBP-2和P21。这两种蛋白质调控细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡过程。3.应用蛋白质芯片技术可以一次性高通量筛选疾病相关蛋白质,我们将此技术用于肝癌高发区肝癌血清标志物的研究,检测到的差异蛋白质,可能与广西肝癌高发区肝癌发生发展相关。对这些蛋白质进行验证研究将为寻找肝癌高发区肝癌血清预警标志物提供线索和依据。第四部分差异蛋白IGFBP-2和P21在广西肝癌高发区肝癌患者血清中的验证目的:从蛋白质芯片结果中挑选出的在肝癌组和对照组血清中有差异的蛋白质IGFBP-2和P21,增大各组样本的例数,比较两组标本血清IGFBP-2和P21的浓度,以验证蛋白质芯片结果的可靠性,并初步探讨这些蛋白质与广西肝癌高发区肝癌之间的关系。方法1研究对象:从广西肝癌高发区高危人群队列中选择肝癌病例44例,按照1:1的比例配比,选择同一地区的高危人群44例作为对照组。所有研究对象在采血时未进行手术、放化疗以及生物治疗,并在知情同意情况下进行问卷调查和采血。2研究方法:采集非抗凝血5ml,离心分离血清后,应用ELISA方法检测两组研究对象血清IGFBP-2和P21的浓度,与高发区肝癌患者的流行病学资料结合分析,初步探讨IGFBP-2和P21与肝癌高发区肝癌的关系。结果:肝癌患者血清IGFBP-2浓度为2846.66±1834.74ng/L,对照组血清IGFBP-2浓度为1657.39±577.55 ng/L,两组标本血清IGFBP-2浓度有统计学意义(P<0.05);肝癌患者血清P21浓度为2925.81±1144.74ng/L,对照组血清P21浓度为7848.43±1834.74ng/L,两组标本血清P21浓度有统计学意义(P<0.05)。结论:在肝癌患者血清中,IGFBP-2的含量上升,而P21蛋白质含量下降,提示IGFBP-2和P21两种蛋白质可能参与了广西肝癌高发区肝癌发生发展过程,血清IGFBP-2和P21两种蛋白质可能成为肝癌高发区肝癌预警肿瘤标志物。在扩大样本例数以后,ELISA方法的研究结果与蛋白质芯片研究结果基本一致,提示蛋白质芯片是一种可行的研究技术,其研究结果具备一定的可重复性。