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多糖是一类广泛存在于动植物、微生物中的重要的生物大分子物质。随着分子生物学研究的不断深入,人们逐渐发现不同来源的多糖具有广泛而复杂的生物学活性,多糖的研究已引起了医药界的高度重视,并成为当今生命科学研究的热点之一。美国于2001年启动了“功能糖组学计划”,日本也开展了“糖工程前沿计划”,其整体目标是阐明糖链的生物学功能,并设计出治疗心血管疾病、癌症、感染性疾病等多糖类药物。我国对多糖类的研究起步较晚,但进展迅速,尤其在多糖类的生物学功能研究方面取得了较快的进展。海洋是生物多糖的一个重要来源地,随着对陆地植物、真菌多糖的大量开发,海洋生物多糖也越来越引起人们的注意。目前海洋多糖的开发研究较多集中在海洋植物,多种海藻多糖的结构得到了阐明并被发现具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗放射性、抗衰老等作用。而对海洋动物多糖的相关研究报道则较少。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)属于海洋软体动物门,双壳纲,贻贝目,贻贝科,盛产于我国渤海、黄海等海域,在我国北方称海红,江浙一带称淡菜。已有研究表明,贻贝提取物有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、抗酒精性肝损伤和抗菌的功能和增加机体免疫能力、降低血脂含量的功效。而多糖是其中重要的有效活性成分之一。我室对海洋动物多糖的研究已有多年的基础,本文主要对东海厚壳贻贝多糖MP-Ⅰ(Mytilus coruscus polysaccharide MP-Ⅰ)进行了分离纯化、结构鉴定及生物学活性研究。1. MP-Ⅰ的分离纯化。通过新鲜厚壳贻贝肉组织匀浆、热水抽提、水提液Sevag法除蛋白的方法得到多糖粗品。多糖粗品经DEAE-Sepharose阴离子交换树脂分离,Sepharose CL-6B凝胶反复纯化。多糖的纯度经旋光度测定和高效液相色谱法(HPLC)检测, HPLC法测定分子量。同时,对分离纯化的条件进行了优化。2. MP-Ⅰ的结构鉴定。通过对MP-Ⅰ进行紫外(200-400nm)扫描、红外扫描、单糖组分测定(气相色谱及硅胶薄层层析)、甲基化分析、高碘酸氧化分析、核磁共振分析、糖醛酸含量测定、硫酸根含量测定,最终确定MP-Ⅰ的化学结构。3. MP-Ⅰ的生物学活性研究。(1) MP-Ⅰ抗小鼠急性肝损伤作用的研究。将昆明小鼠随机分成6组:①正常组(生理盐水+橄榄油) ;②阴性对照组(生理盐水+ CCl4橄榄油) ;③阳性对照组(苦参素,30 mg·kg-1·d-1 + CCl4橄榄油) ;④MP-Ⅰ高浓度组(MP-Ⅰ100 mg·kg-1·d-1 + CCl4橄榄油) ;⑤MP-Ⅰ中浓度组(MP-Ⅰ50 mg·kg-1·d-1 + CCl4橄榄油) ;⑥MP-Ⅰ低浓度组(MP-Ⅰ25 mg·kg-1·d-1 + CCl4橄榄油)。实验室常规饲养3 d后,各组小鼠腹腔注射不同药物0.2ml/只:正常组和阴性对照组注射生理盐水、阳性对照组注射苦参素、MP-Ⅰ三个组分别注射不同剂量的多糖。连续7 d,末次注射2h后,空白对照组腹腔注射0.2ml/20g的橄榄油,其余各组腹腔注射0.2ml/20g剂量的0.2% CCl4橄榄油溶液,制备急性肝损伤模型。24h后各组小鼠眼眶取血,颈椎脱臼法处死后取肝,测定各组小鼠肝指数、血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST) ,肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平。光镜下观察肝组织切片的病理学变化。(2) MP-Ⅰ对肿瘤细胞生长抑制作用的研究。设立MP-Ⅰ三个浓度组(500μg/ml、100μg/ml、20μg/ml)分别作用于体外培养的HO-8910、MCF-7、K562、SMMC-7721、HL-60、Hela六种肿瘤细胞,MTT法测定不同浓度MP-Ⅰ对肿瘤细胞生长的抑制作用。实验结果显示,经过分离纯化后得到的贻贝多糖纯品MP-Ⅰ为白色粉末,水溶性佳,分子量为1350KDa。经分离纯化条件的优化,缩短了分离纯化的时间,纯多糖得率提高至贻贝鲜组织的2.14%。结构鉴定表明,MP-Ⅰ是以α-D- (1→4) Glc为主链,α-D- (1→6) Glc连接为侧链的葡聚糖,其化学结构为:抗小鼠急性肝损伤结果表明,MP-Ⅰ高浓度组(100 mg·kg-1·d-1)能显著降低CCl4急性肝损伤小鼠血清谷丙氨酸(ALT)、谷草氨酸(AST)水平(P<0.01) ,降低肝组织丙二醛(MDA)水平(P<0.01) ,增高肝组织超氧化物岐化酶(SOD)水平(P<0.01)。中浓度组(50 mg·kg-1·d-1)能显著降低CCl4急性肝损伤小鼠血清ALT (P<0.01)、AST水平(P<0.05) ,降低肝组织MDA水平(P<0.05) ,增高肝组织SOD水平(P<0.01)。MP-Ⅰ低浓度组(25 mg·kg-1·d-1)能显著降低CCl4急性肝损伤小鼠血清ALT水平(P<0.01) ,但对血清AST、肝组织MDA和SOD水平无显著影响(P>0.05)。阳性对照组(30 mg·kg-1·d-1)能显著降低CCl4急性肝损伤小鼠血清AST水平(P<0.01) ,降低肝组织MDA水平(P<0.05) ,增高肝组织SOD水平(P<0.05) ,但对血清ALT水平并无显著降低作用(P>0.05)。肝脏病理组织学显示,MP-Ⅰ能明显抵御肝损伤小鼠肝细胞坏死和炎症细胞入侵,改善肝脏病理学损伤程度,且与剂量呈正相关。但各组小鼠的肝指数无显著差异。体外抑制肿瘤细胞生长作用研究表明,MP-Ⅰ三个浓度组对体外HO-8910,MCF-7,K562,SMMC-7721四种肿瘤细胞均有不同程度的生长抑制作用(P<0.01) ,其中高浓度组对HO-8910、MCF-7肿瘤细胞的抑制率分别为30.55%和36.38%。结论:获得分子量为1350 KDa的多糖纯品MP-Ⅰ;MP-Ⅰ是以α-D- (1→4) Glc为主链,α-D- (1→6) Glc为支链的葡聚糖;MP-Ⅰ对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤有显著的保护作用,与剂量呈正相关;MP-Ⅰ对体外肿瘤细胞的生长有抑制作用,对HO-8910,MCF-7肿瘤细胞的生长抑制作用最为显著。