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目的:分析并阐明酒精对原代睾丸间质祖细胞(PLC)雄激素合成的调控机制,为日后临床诊断和治疗免疫相关及酒精作用导致的男性性腺机能低下、生殖障碍及睾酮缺乏等疾病提供新的靶标和治疗方法。方法:首先以不同浓度的酒精分别处理PLC,然后通过分子生物学及放射性酶联免疫方法(RIA)检测PLC中雄激素合成酶的表达量及雄激素产量。然后,利用RT-PCR方法,分析PLC中miR-299a-5p的表达量。其次,利用转录组测序的方法(RNA-Seq)从基因表达水平上分析抑制miR-299a-5p的表达对不同发育阶段LC雄激素合成及其调控具体靶标。使用免疫沉淀方法(CO-IP)结合信息学方法,分析miR-299a-5p及其调控靶标NFκB1介导的信号通路。最后,以长效miR-299a-5p抑制剂进行睾丸内局部注射,从动物实验验证该miRNA调控PLC雄激素的合成功能。结果:RIA测定结果显示,终浓度为30μM,120μM和480μM酒精可使PLC合成孕酮的产量分别为4.62±0.13,3.56±0.41及0.91±0.43 ng/106细胞,与对照组相比,分别下降了26.4%,42.6%和85%。RT-PCR分析显示,酒精能迅速抑制PLCs中类固醇合成限速酶基因Hsd3b1的表达。对PLC中micro RNAs的筛选后发现,miR-299a-5p是酒精作用的靶基因之一,且参与其抑制PLC雄激素合成的过程。以不同发育阶段LCs作为研究对象,转染miR-299a-5p inhibitor并测定其激素含量。结果表明,降低miR-299a-5p的表达能显著提升Cyclin D的表达,但抑制PLC、ILC及ALC合成雄激素的产量(分别为6.76±1.29,13.84±3.62和3.40±0.32 ng/106细胞),与对照组相比,分别下降88.35%,81.54%和93.61%。此外,下调miR-299a-5p的表达也能显著抑制HSD3B1的表达。转录组学分析提示,miR-299a-5p主要参与细胞和组织发育、应激反应、免疫系统调节、激素合成调控以及细胞增殖等生物学过程。双荧光素酶实验检测结果证实,miR-299a-5p在LC中主要的靶基因是Nfκb1,而过表达Nfκb1同样可抑制PLC中Hsd3b1的表达量及雄酮的合成。对雄激素合成限速酶基因Star、Cyp11a1及Hsd3b1等启动子区分析显示,除Star基因外,其余均没有没有Nfκb1的结合基序。免疫共沉淀实验进一步证实,过表达Nfκb1并不与HSD3B1表达下调直接相关。Ingenuity Pathway Analysis(IPA)分析结果显示,Nfκb1介导的差异蛋白主要集中在雄激素通路以及IL信号通路上。通过RT-PCR方法对PLCs细胞因子转录进行分析,结果表明,PLCs中IL-1α、IL-1β以及IL-6 m RNA的表达量分别比对照组的上调3.54、3.50及5.73倍,但另外一种促炎因子TNF-α的表达量却没有显著变化。在动物实验方面,抑制miR-299a-5p的表达能引起睾丸内产生严重炎症浸润病变、曲细精管结构破坏严重。由于IL-1及IL-6通过下调HSD3B1的表达而抑制LC合成雄激素已被证实,因此,酒精具有抑制PLCs分化及雄激素合成的毒性,其机制主要通过下调PLC中miR-299a-5p的表达,进而增加Nfκb1转录并激活IL-1和IL-6的表达,最后以自分泌和旁分泌方式作用调控其分化及雄激素的合成。结论:酒精可以显著降低PLC合成雄激素的产量,其机制主要通过抑制miR-299a-5p的表达量,进而上调其靶基因Nfkb1的表达,并促进PLC中IL通路上关键蛋白IL-1及IL-6的表达,最终抑制雄激素合成关键蛋白HSD3B1的表达。此外,动物实验表明,睾丸内局部注射miR-299a-5p抑制剂还可以导致睾丸发生严重炎症浸润,曲细精管结构破坏。