手足口病（Hand-food-and-mouth disease）是由肠道病毒引起的全球性传染病，在世界各地均有不同规模的爆发流行，我国自1981年在上海始见本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、安徽、湖北、广东等十几个省市均有报道。手足口病多发生于5岁以下儿童，报告的病例以婴幼儿为主，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症，个别重症患儿甚至死亡，已成为世界性的公共卫生问题，引起了广泛重视。为加强手足口病防治工作，我国卫生部将手足口病列入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。目前，在全世界范围内还缺乏有效地抗病毒药物，研制有效的疫苗是控制手足口病感染流行的最有效策略。本论文针对手足口病的两种相关病毒，设计并测试了以病毒包膜蛋白为基础的候选疫苗分子，为手足口病的有效预防奠定研究基础。一、VP1抗原的免疫效应及交叉保护作用引起手足口病的主要病毒包括肠道病毒71型和柯萨奇病毒组。有研究表明VP1蛋白作为病毒的主要抗原，在小鼠模型上针对病毒感染可提供一定的保护效果。本研究中我们应用原核表达系统分别重组制备了肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇B3病毒（CB3）的VP1蛋白。以EV71抗原VP1（EVP1）、CB3抗原VP1（CVP1）为单一或混合免疫原分别对成年BALB/C小鼠进行免疫，诱导机体产生了较高的特异抗体效价，表明VP1蛋白具有良好的免疫原性；免疫血清的病毒中和活性测试显示EVP1免疫组血清对EV71病毒的中和效价为1：832，CVP1免疫组血清对CB3病毒的中和效价为1：1024；在对其子代新生乳鼠的攻毒试验中，两种VP1抗原均可对特异病毒提供较好的保护效果，EVP1免疫组对160LD50的EV71病毒攻毒可提供完全保护，CVP1免疫组对150LD50的CB3病毒攻毒保护率达88.9%；提高攻毒剂量EVP1抗原免疫组针对200LD50的EV71病毒攻毒保护存活率达70%，CVP1抗原免疫组对180LD50的CB3病毒攻毒保护存活率达75%。进一步的病理分析结果显示，相对于攻毒组严重的肺组织损伤，心肌炎，肠道等病理损伤，免疫保护组小鼠各器官病理损伤减轻或者消失。在两种抗原的交叉保护试验中，发现EVP1免疫组对150LD50的CB3病毒保护效果达60%，而CVP1免疫组对高剂量的EV71病毒没有保护效果，对低剂量的EV71病毒（15LD50）攻击的保护效果仅有27.3%。此外，我们还成功构建了包含EVP1与CVP1分子结构的融合蛋白ECVP1。经原核表达和亲和层析纯化获得目的蛋白，并初步验证其免疫反应性，ECVP1可同时被针对两种病毒的特异抗血清识别。二、VP1抗原嵌合菌蜕构建及免疫效应研究本研究利用实验室构建的革兰氏阴性菌通用型夹心外膜展示载体pSOMPA，成功将EVP1或CVP1分子在O157：H7菌蜕外膜上锚定表达。在新构建的嵌合菌蜕（EBGs，CBGs）结构中，将原有的O157：H7细菌膜表面抗原与新的EV71保护性抗原EVP1或CB3保护性抗原CVP1共同表达于菌蜕外膜。两种嵌合菌蜕免疫小鼠后除了诱导小鼠体内产生抗O157：H7菌蜕特异抗体（抗intimin特异抗体）外，还诱导产生了抗VP1抗原的特异抗体。与阴性对照相比，嵌合菌蜕（EBGs或CBGs）不但可以保护小鼠抵抗20MLD的E.coli O157:H7活菌的灌胃攻击（70%或75%），同时免疫所产子代小鼠对致死剂量（2LD50）的同种病毒EV71或CB3的攻毒有免疫保护能力，EBGs免疫组可提供100%的完全保护，CBGs免疫组保护率达到87.5%；当攻毒剂量提高时，EBGs组抵抗5LD50的EV71攻击的保护率为50%，CBGs免疫组抵抗5LD50的CB3病毒攻击的保护率为37.5%。因此，采用VP1抗原嵌合表达的O157：H7嵌合菌蜕免疫策略既能使机体防护O157:H7病原菌的感染，又能提供对EV71和CB3病毒的免疫保护，可以为新型联合疫苗的发展提供基础。