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强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性进行性炎症疾病,是脊柱关节病(spondyloarthropathies,SpA)的一种。主要侵犯骶髂关节、脊椎关节与附近的肌腱、韧带等软组织,炎症后继发纤维化与钙化,使脊椎逐渐失去柔软度,严重时会发展到像“竹节”一样无法弯曲或伸展。AS的主要病理特征包括:骶髂关节炎、脊柱的炎症、脊柱的新骨形成以及可能发生的关节融合。AS具有两个主要的发病阶段:首先是炎症引发的骨侵蚀性损伤,随后是骨形成导致的韧带骨赘的出现。炎症和骨化,这两个强直性脊柱炎疾病进展过程中典型的病理特征是否有特定的转化时期,是否存在必然的联系,以及这两个病理阶段是怎样的转换机制并不清楚。文献中报道的关于炎症和骨化的研究很多,但利用相同的实验原理和实验方法却得到了不一致,甚至相悖的实验结论。这说明不同患者自身存在的差异是影响结果统一的主要原因。同时发现,有些AS患者发病不久就出现明显的骨化和关节强直现象,而有些长期患病患者却未出现病理性骨化现象,同样说明患者之间骨化程度存在个体差别。因此,利用不同病期患者之间存在的本质差异作为研究对象,并发现相关的血清学标志物对研究AS病理进展机制和建立简单广泛的血清学诊断至关重要。本实验首先选取炎症和骨化相关因子DKK-1和TNF-α作为研究对象,TNF-α是主要的促炎症细胞因子,与疾病的活动程度和炎症状态有关,在RA患者和关节炎动物模型发病过程中起关键作用。Wnt信号通路是具有代表性的骨平衡相关信号通路,DKK-1作为Wnt信号通路的抑制剂已经得到证实;同时在关节炎动物模型中研究发现,阻断DKK-1可以诱导小鼠的关节融合,说明DKK-1在关节炎动物模型中对于关节重塑起重要的调节作用。通过检测AS、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)和健康对照血清中DKK-1和TNF-α的表达水平,初步了解炎症和骨化相关因子在AS中的表达意义以及不同病期AS患者血清因子是否存在统计学差异,为下一步进行不同病期AS血清差异表达谱的筛选与鉴定提供理论依据。然后选择早期和中晚期AS患者的血清作为研究对象,利用蛋白质组学和质谱鉴定技术筛选出了其他与炎症或骨化相关的生物标志物,并通过ELISA进行验证,为AS患者的临床早期诊断和简单广泛的血清学诊断奠定基础。本研究分为两个部分：
第一部分：强直性脊柱炎患者血清中DKK-1的表达及其意义。
目的：检测不同病期强直性脊柱炎(ankylosing sporidylitis,AS)患者血清中Dickkopf-1(DKK-1)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达水平,初步探讨成骨相关因子表达水平与AS的关系。
方法：采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测47例AS患者(包含22例早期患者和25例中晚期患者)、20例类风湿性关节炎(RA)患者和20例健康对照人群血清DKK-1和TNF-α的表达水平。
结果：AS和RA患者血清中DKK-1和TNF-α水平明显高于正常对照,AS和RA患者组相比较血清DKK-1和TNF-α水平没有显著差异。中晚期AS患者DKK-1水平较早期患者明显降低,TNF-α表达也有降低,但无显著差异,Spearman分析显示,AS患者血清DKK-1和TNF-α表达水平正相关。
结论：随着AS骨化程度的进展,DKK-1表达呈下调趋势,提示DKK-1的表达下调可能参与了AS患者的骨化,DKK-1可能是与AS骨化程度相关的血清标志物。
第二部分：不同病期强直性脊柱炎血清差异蛋白的筛选与验证。
目的：通过比较不同病期强直性脊柱炎患者血清的差异表达蛋白,以发现与强直性脊柱炎临床分期和骨化相关的蛋白,为临床预后和复发的预测提供新指标。
方法：收集不同临床分期的强直性脊柱炎血清,分为早期组和中晚期组,各9例,进行高丰度蛋白和IgG的去除后,提取血清总蛋白进行二维凝胶电泳,选择部分差异表达蛋白进行MALDI-TOF质谱分析和生物信息学分析,然后对85例AS患者(39例早期和46例中晚期)的血清进行ELISA检测,进一步验证候选蛋白标志物的表达水平。
结果：利用去除血清高丰度蛋白和IgG蛋白的方法,建立了早期强直性脊柱炎和中晚期强直性脊柱炎的二维凝胶电泳图谱,通过进行质谱分析和生物信息学查询,鉴定了显著差异蛋白的8个蛋白点,在早期组上调的6个,包括补体B、补体Ⅰ、α-2-巨球蛋白、结合珠蛋白、丛生蛋白和凝血酶原;中晚期组上调的2个,包括血红蛋白β亚基和补体C3。然后选择凝血酶原作为候选差异蛋白标志物,ELISA检测显示早期患者为81.8±12ng/L,中晚期患者为44.2±6.6ng/L,P＜0.01具有显著的统计学差异,证实了其在不同病期AS患者血清中表达的差异性。
结论：不同临床分期的强直性脊柱炎血清之间存在差异表达蛋白,说明AS患者随着病理阶段的不同,骨化相关因子的表达有显著差异;凝血酶原随着骨化程度的进展,表达呈下调趋势,提示凝血酶原的下调可能参与了AS患者的骨化,凝血酶原可能是与AS骨化程度相关的血清标志物,也可能作为AS早期诊断的一个候选血清标志物。