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大量的实验证据表明,NRGs在心脏发育与功能维持中起到重要的作用。上海泽生科技有限公司成功的将重组人NRG1(纽兰格林)应用到临床,治疗扩张性心衰。动物实验结果表明纽兰格林不仅对胚胎期心脏心肌发育起重要的作用,也可以通过激活ErbB2／ErbB4受体酪氨酸激酶异源二聚体改善心衰症状,防止成熟心脏功能障碍和早期死亡。
NRG1的受体包括ErbB4和ErbB3。除ErbB4在心肌中高表达外,ErbB3广泛表达于神经系统和各种肿瘤组织。NRG1在临床中的一个担忧是该药物可能会通过激活ErbB3产生非期望的副作用。本研究的主要目的在于通过建立分别代表ErbB3和ErbB4高表达的细胞株作为不同组织的细胞模型,建立一个心肌特异性ErbB4配体筛选系统,并筛选心肌特异性的NRG1突变体。
本研究构建了带有不同筛选标记的ErbB2,ErbB3,ErbB4细胞表达质粒,将ErbB2／ErbB3、ErbB2／ErbB4质粒共转染至CHO细胞,建立了ErbB2／ErbB3特异性表达和ErbB2／ErbB4特异性表达的细胞株。通过与新生大鼠原代心肌细胞比较,证明ErbB2／ErbB4细胞株信号传导功能与心肌细胞相似,NRG1可以激活下游的ANT信号途径、P13K信号途径,并表现出良好的剂量效应。然后我们构建了31个不同的NRG1突变体并在大肠杆菌中成功的表达和纯化。将这些突变体用于刺激两个细胞株,通过检测与心功能密切相关的下游信号磷酸化AKT,发现这些突变体激活ErbB3与激活ErbB4的能力不同。我们最终获得了四个受体结合与激活能力发生改变的突变体作为特异性NRG—1突变体。磷酸化AKT的检测实验表明,这些突变体可以特异性的激活ErbB4受体,至少部分的降低了其非特异性激活神经与肿瘤组织中ErbB3的能力,从而可以减少非必要的副作用。
在该研究中,我们完成的工作包括:1)我们建立了一个细胞筛选系统,可以用于筛选相对与ErbB3而言,具有更高ErbB4特异性的配体,或相反的特异性配体可以推测,该系统也可以用于特异性抑制剂的筛选。2)在大肠杆菌中表达并纯化了31个不同的NRG1突变体,通过上述系统的筛选,确立了4个更特异性激活ErbB4受体的突变体。3)建立了一个可以替代原代细胞用于NRG1活性检测的细胞系统,与原代细胞相比,该系统具有更好的稳定性和方便性。