研究背景子宫内膜异位症(endometriosis, EMS,简称内异症)是子宫内膜组织种植和生长在子宫腔以外的一种慢性、雌激素依赖性的疾病。作为最为常见的妇科疾病之一,内异症在育龄期女性中的发病率为10%-15%,以慢性盆腔痛、痛经、不孕为主要症状。高达35%-50%的慢性盆腔痛和不孕患者诊断为内异症,发病率呈上升趋势。大量的证据表明雌激素在异位病灶的建立和发展中起着重要的作用。然而,其发病机制尚不明确。主要的学说和发病因素包括：(1)异位种植学说,包括经血逆流学说和淋巴和静脉学说,经血通过输卵管进入盆腔,76%～90%的生育期女性中存在经血逆流的情况,但其中只有很少一部分女性发生内异症。此学说不能解释青春期、新生儿的内异症。(2)体腔上皮化生学说及诱导学说,假设内异症是由内脏和盆腔腹膜的间皮细胞化生而来,卵巢激素和免疫因子可刺激体腔上皮分化而来的组织和未分化的腹腔组织向内膜样组织转化。但由于青春期少女的雌激素水平是不高的,因此该学说只可解释部分的青春期的内异症；(3)苗勒氏管发育异常学说；(4)遗传因素,此学说基于内异症有一定的家族聚集性,已发现异位组织中存在染色体异常和表观遗传修饰的异常；(5)氧化应激和炎症因素,脂蛋白的过氧化与内异症的病理有关,导致异位组织的DNA损伤。过量的活性氧也会消除抗氧化物,从而不能清除异位内膜；异位组织产生大量的巨噬细胞、前列腺素、细胞因子和趋化因子等；(6)其他学说及因素,例如干细胞学说和异位内膜细胞凋亡抑制等。本病病因复杂,以上学说均不能完全阐释内异症的发病机制。内异症与癌症之间的组织学联系的假说最早在1925年被提出。Sampson基于在显微镜下观察组织,提出了上皮性卵巢癌起源于内异症,并描述了诊断内异症相关的卵巢癌的诊断标准,包括(1)内异症邻近肿瘤发生的部位的证据；(2)排除其他来源的肿瘤转移；(3)子宫内膜上皮细胞及其周围的特征性的腔上皮腺体样的组织的存在。Scottet在1953年补充了第四条诊断标准,肿瘤组织中,存在内异症的良性改变向恶性改变转变的组织学证据。如今,这四条标准仍然被用来定义内异症相关的恶性肿瘤(endometriosis-associated malignancy, EAM)。内异症是内异症相关的卵巢癌的癌前病变的一个有力的支持是,在异位的内膜组织中发现了很多致癌基因与抑癌基因的突变。大量证据表明内异症与癌症之间存在联系,特别是透明细胞性卵巢癌。因此,异位内膜中的肿瘤抑制因子和致癌因子表达的改变或许会导致异位组织的异常增殖。内异症被认为是遗传学的不稳定,在内异症和卵巢癌中都能发现肿瘤抑制因子的基因突变,如PTEN,p53, bcl, ARID1A和TP53。越来越多的证据表明异常的表观遗传修饰在内异症的发病机制中发挥重要的作用,如DNA甲基化异常、microRNA表达以及组蛋白修饰。另外,在组蛋白去乙酰化酶也存在异常的修饰。H3K27me3是研究较多的组蛋白化学修饰,可沉默基因转录及在干细胞分化和致癌中起一定的作用。Janice B及其团队的实验研究提出,在异位内膜组织中存在着组蛋白3(H3)的甲基化水平升高,H3K4(组蛋白3赖氨酸4位)、H4K9和H3K27高甲基化、类固醇生成因子-1(SF1)的启动子乙酰基化。内异症患者和对照组的分泌期子宫内膜组蛋白3赖氨酸4位的三甲基化(H3K27me3)水平均升高。越来越多的证据表明,表观遗传修饰异常在子宫内膜异位症的发病机制的研究中扮演重要的角色。这些异常的表现包括DNA甲基化、microRNA表达和组蛋白修饰异常等。目前,解释内异症相关的恶性肿瘤起源于内异症的主要有两大理论。学者们通过大量的组织病理学研究后发现, 内异症相关的卵巢癌(endometriosis-associated ovarian cancer, EAOC)可能来源于卵巢部位的不典型内异症。卵巢内异症的这种组织学异质性表现为子宫内膜腺体伴随着异质性的细胞学或非典型的鞋钉细胞。La Grenade和Silverberg在1988年首先提出不典型的内异症与卵巢癌之间有着直接联系。在5例卵巢癌患者(其中包括3例透明细胞癌和2例子宫内膜样癌)中,其卵巢部位均存在不典型的内异症,其中4例的不典型内异症病灶邻近所罹患的卵巢癌。此外,己被证明不典型的内异症患者发展为内异症相关的卵巢癌的风险显著高于单纯的内异症患者。虽然很多流行病学分析支持不典型内异症可能是一种癌前病变,并且也可在80%的内异症相关的卵巢癌中检测出不典型的内异症,但这个结论仍然没有得到足够多的证据。一些研究提出,内异症与内异症相关的卵巢癌所在的微环境有着相似的介质和细胞因子。但内异症相关的恶性肿瘤由异位内膜细胞向恶性转化是否通过它们的中间状态——不典型内异症发展而来以及它们类似的微环境之间的联系仍未被清楚阐明。内异症是具有恶性生物学行为的良性疾病,它有与恶性肿瘤相似的恶性生物学行为,如增殖侵袭和远处转移的能力,异位内膜可以粘附、侵入和破坏所在部位及其周围的组织。但内异症并不像肿瘤那样引起代谢的变化最终导致死亡。研究发现,内异症患者的上皮性卵巢癌和透明细胞癌风险增加。FOXM1在上皮性卵巢癌中表达丰富并与低生存率和耐药性有关。如今的治疗方式可分为症状性的和有生育需要的治疗,例如手术和常规的激素治疗。所有的这些治疗方式都是局限的,并且存在很多副反应。然而,在这些治疗中断之后存在较高的复发率。叉头转录因子(Forkhead Box M1,FOXM1)是在细胞增殖、分化和转化过程中发挥重要作用的一种转录因子。作为在肿瘤形成的早期就被上调的蛋白,FOXM1已经被证明在肿瘤的各个阶段均起着重要作用。FOXM1在各种各样的实体肿瘤和血液系统的肿瘤中都存在过表达,如肝细胞癌、急性髓性白血病、胰腺癌和卵巢癌。Ras/MAPK(Ras, ERK). AKT和p38信号通路是在肿瘤中经常被激活的通路,而这些通路也可以调节FOXM1的表达。噻唑类抗生素是转录因子FOXM1的小分子抑制剂,包括丝裂霉素A和硫链丝菌肽,都在多种肿瘤的体内外实验中被证明有抗肿瘤活性。这些抑制剂可以抑制FOXM1的转录,有较高的特异性,而对其他的转录因子不会产生影响。硫链丝菌肽不仅是一个噻唑类抗生素,而且是一个蛋白酶体抑制剂,调节FOXM1的转录活性和表达。它能通过不同的信号通路在很多的肿瘤细胞中产生抗肿瘤的活性。Maqbool等在甲状腺乳头状癌小鼠体内移植模型中发现,硫链丝菌肽通过抑带FOXM1、MMP2和MMP9的表达抑制肿瘤的发展,而在体外实验中,硫链丝菌肽同时可以减少肿瘤细胞的侵袭和转移。在本研究中,我们研究FOXM1在内异症中的表达,探讨雌激素在ERK/FOXM1/MMP9信号通路中的作用机制。最后,在内异症大鼠模型中使用硫链丝菌肽治疗异位病灶,以确定其下调FOXM1和MMP9的表达、促进凋亡和减小异位病灶的能力,评估其疗效。方法1、每天在固定的时间进行大鼠阴道涂片,确定动情周期。连续两个动情周期正常的大鼠纳入本实验中。50只雌性Wistar大鼠通过自体皮下移植法建立内异症模型。2、4周后,所有大鼠进行第二次开腹手术观察异位病灶生长情况,用游标卡尺测量移植物的长宽高(mm),用公式V=0.52*长*宽水高,计算其体积。3、将造模成功的大鼠随机分为去卵巢组和治疗组,每组分别为20只与30只。去卵巢组大鼠经手术去除卵巢后,进一步随机分为雌激素组和对照组。术后观察3天,不给于任何治疗。雌激素组的大鼠皮下注射雌激素(10ug/0.1ml/只／天),而对照组给予等剂量的芝麻油,每组皮下注射7天。治疗组随机分为150mg/kg硫链丝菌肽组、250mg/kg硫链丝菌肽组和对照组(等量生理盐水),腹腔注射,两天一次,共14天。4、用药结束后,用游标卡尺测量病灶体积。组织学染色证实造模成功,免疫染色检测FOXM1在异位病灶中的定位和表达情况。Real-time PCR检测mRNA的水平。Western blot检测各组ERK/FOXM1/MMP9信号通路相关蛋白和Bcl-2的表达。结果1、组织病理学染色：第一次开腹手术28天后,组织病理学确认造模成功。肉眼观,所有造模组的内膜组织均在腹壁发展为典型的异位内膜病灶,半透明囊球状结构内含淡黄或清亮无色液体,病灶表面及周围有血管形成。组织学染色证实可见异位内膜有与正常内膜类似的子宫内膜柱状上皮细胞的腔样结构和与腺体。2、FOXM1的免疫学染色：免疫荧光染色显示FOXM1主要定位在子宫内膜的柱状上皮细胞和基质细胞的细胞核和细胞质。雌激素组与其相对应的对照组相比,FOXM1表达显著升高,且主要表达在细胞核。3、FOXM1和MMP9的mRNA表达：荧光定量PCR结果显示,雌激素组与对照组相比,FOXM1和MMP9基因表达升高(P<0.05)。4、EKR/FOXM1/MMP9信号通路的蛋白印迹分析：蛋白印迹分析表明,雌激素组的磷酸化水平的ERK、FOXM1和MMP9表达水平均高于其相对应的对照组。5、硫链丝菌肽治疗内异症大鼠的疗效评价：(1)治疗前后移植物的体积：两个治疗组与对照组相比,硫链丝菌肽能使腹腔病灶体积明显减小。从大体上看,各个治疗组治疗前体积无明显差异(48.91±22.29mm3,150mg/kg TST治疗组；45.01±16.37mm3,250mg/kg TST治疗组；45.75±15.61 mm3,对照组；P>0.05)。治疗前后,对照组的异位移植物的体积并不存在显著性差异(45.75±15.61 mm3 vs 36.09±19.46 mm3). 250mg/kg TST治疗组异位移植物的体积从治疗前的45.01±16.37 mm3减小到治疗后的15.52±6.93 mm3(P<0.01),与其他两组相比,均有显著性差异。另外,在给予150mg/kgTST治疗后,异位病灶的体积与对照组相比,体积也有所减小差异有显著性意义(23.37±13.65 mm3 vs 36.09±19.46 mm3; P< 0.05)。(2) FOXM1和MMP9的蛋白表达：与对照组相比,硫链丝菌肽治疗能显著降低FOXM1的蛋白表达。治疗后,三组之间两两比较,体积变小明显,有显著性差异(P<0.05)。250mg/kg TST治疗组的MMP9的蛋白表达显著减少,与其余两组比较差异有显著性,但150mg/kg TST治疗组与对照组之间无显著性差异。硫链丝菌肽能通过减小病灶体积和降低FOXM1和MMP9的表达,对内异症大鼠的异位病灶产生显著的抑制活性。(3)抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达：与对照组相比,150mg/kgTST组与250mg/kgTST组Bcl-2表达量降低,差异有统计学意义。两个治疗组相比,Bcl-2的蛋白表达量无统计学差异。结论1、FOXM1在雌激素组的异位内膜中表达丰富,特别是异位子宫内膜柱状上皮细胞的细胞核。2、运用雌激素作用后,ERK/FOXM1/MMP9信号通路蛋白表达升高,表明该通路可能参与了内异症的发生和发展。3、硫链丝菌肽可以减少内异症大鼠异位组织FOXM1和MMP9的表达,且呈剂量依赖性,由此推断硫链丝菌肽有望成为治疗内异症的药物之一。4、硫链丝菌肽下调抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而促进异位病灶的凋亡。