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背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化系统常见恶性肿瘤,目前已成为全球第三大常见癌症。尽管近年来在CRC诊断和治疗方面取得了一些进展,但仍旧迫切需要寻找和开发有效的生物标志物和个性化治疗方案。花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代谢通路中的关键酶—环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在CRC的发生和演进中起关键作用,此外由于AA代谢通路中的ALOX5在调节细胞活性方面具有与COX-2类似的机制,对AA代谢具分流作用,已被发现在多种疾病的发病过程中具有相关性,并可削弱COX-2抑制剂对CRC的治疗效果。因此研究CRC发病机制中COX-2和ALOX5的共调控机制对于今后靶向AA代谢通路治疗CRC策略的开发具有重要价值。而近年来,对非编码RNA的研究结果显示miRNA可通过抑制靶基因的表达发挥致癌或肿瘤抑制功能。目的:因此,本研究拟筛选CRC中可同时靶向COX-2和ALOX5的miRNA,并探讨其在CRC发病机制中的功能和作用机制,并探讨该分子是否可作为CRC诊断和治疗的靶点。方法:1、收集42对CRC肿瘤组织和癌旁正常粘膜组织,并通过qPCR和western blot对组织样本中COX-2和ALOX5 mRNA和蛋白表达水平进行测定;2、Western blot实验对正常结肠上皮细胞系和不同CRC细胞系中的COX-2和ALOX-5蛋白表达水平进行检测;3、根据CRC患者肿瘤组织中COX-2/ALOX5表达水平,将42位患者分成COX-2/ALOX5高表达和低表达组,统计分析COX-2/ALOX5表达水平与患者临床病理特征间的相关性;4、通过权威在线结合位点预测数据库miRWalk、Targetscan、miRanda筛选与COX-2和ALOX-5 mRNA存在结合位点的miRNA,取交集后在CRC组织样本和不同CRC细胞系中进行验证;5、根据CRC患者肿瘤组织中miR-216a-3p(miR-216a)表达水平,将42位患者分成miR-216a高表达和低表达组,统计分析miR-216a表达水平与患者临床病理特征间的相关性;6、MTT实验和Brdu实验验证miR-216a敲低或过表达对CRC细胞增殖活性的影响;7、裸鼠成瘤实验检测miR-216a敲低或过表达对CRC细胞成瘤能力的影响,qPCR检测肿瘤组织中miR-216a的表达,western blot检测COX-2和ALOX5的表达;8、LUC 实验验证 miR-216a 和 COX-2/ALOX5 mRNA3’-UTR 的靶向结合关系;9、Western blot实验检测miR-216a表达变化对COX-2和ALOX5蛋白表达的影响;10、MTT 实验和 Brdu 实验验证 miR-216a inhibitor 和 si-COX-2/ALOX5 共转染对CRC细胞增殖活性的影响。结果:1、统计分析结果显示CRC组织中COX-2和ALOX5 mRNA的表达水平显著高于癌旁正常粘膜组织,并且T3+T4期的CRC患者肿瘤组织中COX-2和ALOX5 mRNA的表达水平显著高于T1+T2期患者;随机选取3对CRC组织和癌旁正常组织进行western blot检测的结果同样显示CRC组织中COX-2和ALOX5蛋白的表达水平高于癌旁正常组织;2、相较于正常结肠上皮细胞NCM460,4种标准CRC细胞系HT29、HCT15、SW480、SW116中COX-2和ALOX5蛋白的表达水平显著上调;3、统计学分析结果显示COX-2/ALOX5表达水平与患者年龄、性别、分化程度、原发肿瘤位置无关,而与肿瘤大小和肿瘤分期显著相关;其后通过Kaplan-Meier分析和时序检验分析COX-2/ALOX5和患者总生存期间的关系,结果显示与COX-2/ALOX5低表达组患者相比,COX-2/ALOX5高表达组患者的预后较差。4、通过 miRWalk、Targetscan、miRanda 预测可同时靶向 COX-2 和 ALOX5的 miRNA,取交集后得到 has-miR-216a-3p、has-miR-6838-3p、has-miR-6833-5p、has-miR-29a-5p。其后通过qPCR检测发现miR-216a在CRC中的下调幅度最为显著;而与 NCM460 细胞相比,HT29、HCT15、SW480、SW116 细胞系中 miR-216a水平显著降低;5、通过Kaplan-Meier分析和时序检验分析miR-216a和患者总生存期间的关系,结果显示与miR-216a高表达组患者相比,miR-216a低表达组患者的预后较差;6、通过MTT和Brdu实验可知转染miR-216a mimcs可显著降低CRC细胞增殖活性,而转染miR-216a inhibitor可显著增强CRC细胞增殖活性;7、通过裸鼠成瘤实验发现miR-216aagomir可显著降低形成肿瘤的体积和重量、增强肿瘤组织中miR-216a的表达、下调肿瘤组织中COX-2和ALOX5的丰度;而miR-216a antagomir可显著增加形成肿瘤的体积和重量、抑制miR-216a的表达、上调肿瘤组织中COX-2和ALOX5的丰度。8、miR-216a mimic 可抑制荧光报告载体 wt-COX-2/wt-ALOX5 的 luciferase活性,而miR-216a inhibitor可增强荧光报告载体wt-COX-2/wt-ALOX5的luciferase 活性,并且 miR-216a 表达变化对载体 wt-COX-2/wt-ALOX5 luciferase活性的影响可被二者间结合位点的突变所消除,表明miR-216可直接靶向COX-2和 ALOX5 的 3’-UTR;9、Western blot的结果显示miR-216a过表达可下调CRC细胞中的COX-2和ALOX5的表达,而干扰miR-216a的表达则可增强细胞中COX-2和ALOX5的表达;10、MTT和Brdu实验的结果显示干扰miR-216a表达可增强CRC细胞的增殖能力,而敲低COX-2或ALOX5表达可抑制细胞增殖能力,并且敲低COX-2或ALOX5表达还可部分回复miR-216a inhibitor对CRC细胞活性的促进作用。结论:本研究首先对CRC中促癌因子COX-2和ALOX5的功能作用进行了研究,结果显示COX-2和ALOX5表达在CRC肿瘤组织和细胞中均显著增高,且两蛋白表达水平与患者肿瘤分期和预后相关联;其后又进一步探讨了肿瘤组织内COX-2和ALOX-5异常高表达的具体机制,通过生物信息学分析,并结合分子、细胞、组织、动物实验验证发现CRC中表达下调的miR-216a可通过解除对促癌因子COX-2和ALOX5的抑制效果,上调细胞中COX-2和ALOX5丰度,最终增强肿瘤细胞的增殖活性。研究结果表明今后miR-216a可能作为CRC早期筛查和诊断的风险因子和治疗靶点,今后有望通过实施miRNA替代疗法,增强肿瘤组织中miR-216a的表达,从而抑制其下游COX-2和ALOX5蛋白水平,达到对CRC的治疗效果,但该方法需要临床实验的进一步验证。