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目的1,3-丁二烯(1,3-Butadiene,BD)被广泛应用于合成尼龙、塑料、橡胶等产品,其作为一种重要的化工原料不仅引起职业人群的健康损害,同时因其在汽车尾气、香烟烟雾及食用油烟中普遍存在被认定居民住宅环境区的主要污染物之一。国际癌症研究组织(IARC)也于2008年认定BD为一级致癌物。它的活性中间代谢产物1,2,3,4-二环氧丁烷(1,2,3,4-diepoxybutane,DEB)具有较强的基因毒性,可以导致遗传物质发生损伤。但其对雄性生殖细胞的损伤与周期阻滞之间的关系及相关机制有待进一步阐明。方法给予100,300,500μM DEB处理GC-2细胞(小鼠精母细胞),采用cck-8和Ed U实验检测细胞增殖情况。运用流式细胞仪检测GC-2细胞内活性氧(ROS)含量以及DEB对GC-2细胞周期和凋亡的影响。通过吉姆萨染色法检测GC-2细胞有丝分裂指数。运用碱性彗星实验、胞质阻滞分裂微核实验、western blot方法分析DEB处理后GC-2细胞的损伤情况。应用western blot检测细胞周期信号通路Chk1/Cdc25c/Cdc2/Cyclin B1蛋白表达及其磷酸化的变化情况。运用免疫荧光法检测Cyclin B1在GC-2细胞胞核中的分布。在以上方法的基础上,提前1h给予10 m M抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理,分析DEB处理后NAC对GC-2细胞ROS含量、g-H2AX蛋白的表达、G2/M周期分布及细胞周期关键调控分子p-Chk1、p-Cdc25c蛋白的影响。提前4h给予Chk1蛋白激酶抑制剂UCN-01处理,观察DEB处理后UCN-01对GC-2细胞周期分布及周期关键调控分子p-Chk1、p-Cdc25c、p-Cdc2的表达情况。为了进一步验证Chk1的重要性,给予Chk1 si RNA检测G2期关键调控蛋白分子磷酸化蛋白的表达情况。同时,我们在小鼠动物体内验证了DEB对生殖细胞周期的影响。选取24只健康成年昆明小鼠(10-12周)适应性喂养一周后,随机分成4组,于第1、3、5天腹腔注射不同剂量的DEB(0、17、34.5、85mg/kg)。在首次染毒后第7天小鼠被处死,采用流式细胞术、组织病理学技术(HE染色)、免疫组织化学法检测DEB对小鼠睾丸细胞DNA含量分布、小鼠睾丸形态学的改变及周期蛋白在小鼠睾丸组织中的表达情况,采用计算机精液辅助分析仪(CASA)检测DEB对小鼠精液参数的改变,通过南京试剂盒检测小鼠肝脏丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及超氧化物歧化酶(SOD)的含量。结果研究发现,DEB处理后可抑制GC-2细胞的增殖,进而通过流式细胞术观察到DEB处理组G2/M期比例显著高于对照组(p<0.05)但无凋亡的发生,表明DEB可诱导GC-2细胞发生G2/M期阻滞。流式分析发现,DEB处理组中DCF平均荧光强度要明显高于对照组(p<0.05),提示DEB可诱导GC-2细胞内ROS含量增加。荧光显微镜下观察DEB处理组GC-2细胞彗星的Tail Length、Tail DNA%、Tail Moment值均明显高于对照组(p<0.05),westen blot结果显示,与对照组相比,随着DEB的增加,γ-H2AX蛋白表达水平显著增加,胞质阻滞分裂微核实验发现,微核、核质桥、核芽突率明显高于对照(p<0.05),这些结果提示DEB可以诱导GC-2细胞发生DNA损伤。同时,吉姆萨染色显示,DEB处理后有丝分裂指数显著增加,免疫荧光法显示Cyclin B1在GC-2细胞核内的表达逐渐减少,western blot结果显示,DEB处理后可上调ATM/Chk1信号通路P-ATM、P-Chk1、P-Cdc25c、P-Cdc2、Cyclin B1的蛋白表达水平,下调有丝分裂期标志蛋白p-H3的表达,提示DEB处理后可诱导GC-2细胞G2期阻滞。为了探讨氧化应激参与了DEB的生物效应,在给予NAC处理后发现ROS含量明显下降,γ-H2AX蛋白表达水平被下调,NAC+DEB处理组G2期比例较与DEB处理组显著降低(p<0.05),而且NAC可以部分逆转DEB对p-Chk1、p-Cdc25c蛋白表达的抑制作用,从而缓解G2期阻滞。为了检测Chk1在G2期的重要性,给予chk1蛋白酶抑制剂UCN-01处理后发现UCN-01+DEB处理组G2期比例较DEB处理组显著降低(p<0.05),且UCN-01+DEB处理组较DEB处理组可下调P-Chk1、P-Cdc25c、P-Cdc2蛋白水平。同时chk1 si RNA+DEB处理组较DEB处理组也可下调P-Chk1、P-Cdc25c、P-Cdc2蛋白水平,提示Chk1在G2期发挥了重要的作用。在DEB腹腔注射小鼠的体内实验中,小鼠精子畸形率显著增加,精子活动力减弱,HE染色结果提示,DEB处理组与对照组比较,小鼠睾丸细胞有空泡及固缩的核形成,曲细精管排列紊乱,精子细胞层数减少及空管的形成。流式结果显示,与对照组相比,各剂量染毒组的四倍体细胞比例显著提高(p<0.05)。免疫组化结果显示,DEB处理组中小鼠睾丸p-H3蛋白表达平均光密度值逐渐减少,P-Chk1蛋白表达的平均光密度值较对照组明显升高。小鼠肝脏组织氧化水平MDA显著增加,抗氧化水平GSH-Px、SOD水平显著减少。结论DEB可能通过氧化应激诱导生殖细胞损伤,引起生殖细胞阻滞在G2期,同时也为DEB作用于男性生殖系统的相关机制提供了线索