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目的:乳腺癌是威胁女性健康的重大疾病。分子靶向治疗是利用肿瘤细胞可以表达,而正常细胞很少或不表达的特定基因或基因的表达产物,形成靶向,最大限度地杀伤肿瘤细胞。目前对ER、PR阳性和/或Her-2过度表达的乳腺癌患者术后的内分泌治疗和赫赛汀分子靶向治疗取得了较好的效果。但对ER、PR、Her-2阴性表达的乳腺癌患者术后没有相应的令人满意的靶向药物治疗。PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路是国际上近年来研究得出的对肿瘤生长调控的主要通路之一,针对该通路的靶向药物的研究是近年来研究的热点。本研究主要研究PI3K/Akt/mTOR传导通路在乳腺癌靶向治疗中的应用价值和联合靶向治疗的意义,为临床中晚期乳腺癌患者的术后治疗打下理论研究的基础。
方法:
1、随机选取我院临床病理证实的乳腺癌患者66例临床资料及病理切片,利用免疫组织化学链霉素抗生物素-过氧化物酶(SP)法检测乳腺癌组织中PTEN和PPARγ蛋白的表达,调取66例乳腺癌患者临床资料,分析乳腺癌组织中PTEN和PPARγ蛋白表达与患者临床分期、病理分型、淋巴结转移率、Her-2、ER、PR表达之间的相关关系。
2、将含有pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒的E coli JM109细胞用液体培养基培养扩增,参照UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒操作步骤抽提质粒,分离纯化质粒并电泳鉴定。采用脂质体转染法将获得的pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒转入COS-7细胞株,传代培养细胞株,West-Blot鉴定PTEN蛋白质的表达。
3、常规连续体外传代培养MCF-7乳腺癌细胞株。将MCF-7细胞按5.0×106/L的浓度接种96孔板,按析因试验设置4个试验组,①转染组:用脂质体转染法将pcDNA3.0-PTEN质粒1μg转染MCF-7细胞;②联合组:给予pcDNA3.0-PTEN转染和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ天然激动剂15d-PGJ2 40μmol/L;③干预组:15d-PGJ2 40μmol/L处理细胞;④对照组:常规培养的MCF-7细胞,不做任何处理。采用MTT法观察15d-PGJ2和质粒转染对MCF-7细胞的生长抑制作用;用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化。
4、常规连续体外传代培养MCF-7乳腺癌细胞株。取对数生长期生长良好的乳腺癌MCF-7细胞株,按2.0×106细胞/孔接种24孔板,按照正交试验L8(27)正交表安排试验。
5、常规连续体外传代培养MCF-7乳腺癌细胞株。在对数生长期消化细胞,制成细胞悬液,按每孔接种3.0×105个细胞,总体积3ml,接种于6孔板。按照正交试验L8(27)正交表安排试验,实验重复3次。
6、用SPSS13.0统计软件,计量资料用表示,组间比较行方差分析。计数资料根据样本理论频数用Fisher确切概率法或χ2检验,指标之间的相关性用交叉分类的2个因素,2水平表的相关分析。检验水准α=0.05(即:P<0.05为差异有统计学意义)。用Excel表绘制细胞生长抑制曲线。
结果:
1、PTEN和PPARγ蛋白在乳腺癌中总阳性率分别为68.2%、63.6%。PTEN阳性的乳腺癌切片中表达阳性部位主要在细胞核内占72.86%,胞浆表达占27.14%。PPARγ蛋白阳性乳腺癌切片主要表达在核膜占87.3%。相关分析表明PTEN与PPARγ、ER、PR、HER-2阳性率无显著相关(P均>0.05)。PPARγ与ER、PR、Her-2阳性率无显著相关(P均>0.05)。在66例乳腺癌病理切片中PTEN阳性乳腺癌患者淋巴结转移率为49.23%(288/585),PTEN阴性乳腺癌患者淋巴结转移率为66.37%(231/348)。PPARγ阳性乳腺癌患者淋巴结转移率为54.41%(351/645),PPARγ阴性乳腺癌患者淋巴结平均转移率为58.33%(168/288)。PTEN和PPARγ蛋白表达双阳性淋巴结转移率为51.59%(243/471),PTEN和PPARγ蛋白表达双阴性淋巴结转移率为70.68%(123/174)。
2、实验得到的pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒大小约为6.0 kb,质粒浓度为0.0803 μg/μl。该质粒目的基因在COS-7细胞株表达产物经West-Blot鉴定证实为目的基因表达产物。
3、MTT法检测细胞吸光度(A)值结果显示,与对照组相比,pcDNA3.0-PTEN质粒转染、15d-PGJ2干预均能有效地抑制MCF-7细胞生长。在48、72、96h时点,联用组的效果较其他两组的抑制作用更明显(P<0.05)。用A值计算细胞抑制率,对照组细胞在各时间点均未显示出生长抑制;24h时点转染组、联合组、干预组的细胞抑制率分别为2%、0%、0%;在48h时点分别为28%、39%、26%;在72h时点分别为74%、84%、70%;在96h时点分别为85%、89%、80%。细胞周期检测结果显示,与对照组比较,转染组对G0、G1期细胞的阻滞作用较强(P<0.05),干预组作用较弱(P<0.05)。联合组的G0、G1期阻滞效应较转染组弱(P<0.05),但较干预组强(P<0.05)。细胞凋亡检测显示,与对照组相比,转染组、干预组和联合组均不能有效地诱导MCF-7细胞凋亡(P<0.05)。联合组细胞凋亡率低于干预组(P<0.05),转染组的细胞凋亡率与联合组、干预组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3.0-PTEN质粒转染与15d-PGJ2 40μmol/L干预有交互作用,联用组与其他两组比较,细胞凋亡率下降(P<0.05)。
4、罗格列酮、5-氮杂-2′-脱氧胞苷和雷帕霉素均能能有效的抑制体外培养的乳腺癌细胞株MCF-7的生长,雷帕霉素的抑制率最大(P<0.05)。联合用药能明显增加细胞生长抑制率(P<0.05)。雷帕霉素在中低浓度干预,MCF-7细胞凋亡率最大。增加浓度不增加凋亡。在中低浓度雷帕霉素与罗格列酮联用不增加细胞凋亡(P<0.05)。雷帕霉素联合5-Aza可增加细胞凋亡(P<0.05)。随着浓度的增加,5-Aza干预使细胞G1比例逐渐下降,S期比例逐渐上升(P<0.05)。
结论:
1、在乳腺癌组织中PTEN和PPARγ的表达均有缺失或非正常表达。随着临床分期的进展PTEN、PPARγ阳性率均下降,PTEN表达位置由正常细胞浆表达转为细胞核表达。PPARγ由正常核膜表达转为胞浆核膜表达。PTEN、PPARγ、ER、PR、Her-2的表达之间无显著相关性。PTEN和PPARγ蛋白双阴性表达的患者淋巴结转移率高,双阳性表达的患者淋巴结转移率低。
2、pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒内含有所需目的基因,该真核表达系统能在真核细胞株COS-7表达所需目的基因产物,可以应用该质粒对PTEN基因缺失或杂合性缺失的肿瘤细胞进行试验性治疗。
3、pcDNA3.0-PTEN质粒转染、15d-PGJ2干预均能有效地抑制体外培养的MCF-7细胞细胞株的生长。pcDNA3.0-PTEN质粒转染和15d-PGJ2联合干预细胞抑制率优于独立用药,两药有交互作用。两药的可能作用机制为周期阻滞和诱导细胞分化,而凋亡作用不明显。pcDNA3.0-PTEN质粒转染与15d-PGJ2 40μmol/L干预有交互作用,两者联用细胞凋亡率下降。
4、雷帕霉素、罗格列酮和5-氮杂-2′-脱氧胞苷三种药物均能有效的抑制体外培养的MCF-7乳腺癌细胞的生长。雷帕霉素的抑制作用最为显著。雷帕霉素抑制MCF-7乳腺癌细胞的主要机制为诱导早期凋亡和抑制细胞有丝分裂。罗格列酮抑制MCF-7乳腺癌细胞的主要机制为周期阻滞,能有效的将乳腺癌细胞阻滞于G0~1期。5-氮杂-2′-脱氧胞苷抑制MCF-7乳腺癌细胞的主要机制为诱导晚期凋亡,这可能与细胞分化有关。雷帕霉素取8.0×10-4mg/L,罗格列酮和5-氮杂-2′-脱氧胞苷取50 μmol/L抑制乳腺癌细胞生长,联合用药意义最大。