长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA,基因组中大约只有2%的基因能够编码蛋白质,剩下的约98%的基因并不具有蛋白编码的功能。近年来越来越多的研究表明lnc RNA在多种肿瘤的发生发展中扮演者重要的角色。lnc RNA可以调控肿瘤细胞的增殖、细胞运动、血管新生以及细胞骨架的形成。肺癌是所有癌症中发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,肺癌病人的五年生存率仍然保持在15%左右。肺癌的发病率和死亡率高居不下不仅仅与空气污染和环境恶化相关,同样的也因为肺癌的在早期难以诊断,缺乏相应的早期诊断标志物。因此开发肺癌早期诊断标志物迫在眉睫。目前,长链非编码RNA在肺癌发生中的生物学功能以及临床研究意义还不够清楚。因此研究lnc RNA在肺癌发生发展中的作用机理以及将lnc RNA作为其早期诊断标志物有着重要的基础与临床研究意义。为探究lnc RNAs在肺癌发生中扮演的角色,我们首先对TCGA数据库中的485例肺腺癌样本和56例癌旁样本的RNA-seq数据进行lnc RNA鉴定和差异表达分析。我们鉴定筛选出一条新的lnc RNA,命名为LCAT1(Lung Cancer Associated Transcript 1)。LCAT1位于2号常染色体的长臂端31.1区域。CAPT(Coding Potential Assessment Tool)和CPC2(Coding Potential Calμlator2)对LCAT1蛋白编码能力进行预测,显示LCAT1的蛋白编码能力极低,这进一步确定了LCAT1是非编码RNA。因此在本研究中,我们将LCAT1作为研究对象来探究其在肺癌发生发展中作用机制的研究,并得出了以下结果:一、LCAT1在肺癌组织中表达上调并且与肺癌病人的预后成负相关对TCGA数据库中肺癌RNA-seq数据进行分析我们发现LCAT1在肺腺癌组织中的表达高于癌旁组织,并通过q PCR对这一分析结果进行验证。结合肺癌病人的预后信息分析发现LCAT1表达高的病人生存时间比低表达病人生存时间短。二、LCAT1沉默能在体内和体外抑制肺癌细胞的增殖为了研究LCAT1在肺癌细胞中的生物学功能,我们检测了LCAT1在肺癌细胞中的表达。结果显示LCAT1在肺癌中普遍表达,因此我们在高表达LCAT1的细胞中用小干扰RNA(si RNA)沉默其表达或在表达低的细胞中过表达LCAT1,并对其细胞增殖进行检测,结果表明LCAT1敲低能够显著抑制肺癌细胞的增殖。在A549细胞中用sh RNA(Short hairpin RNA)稳定敲低LCAT1,把LCAT1沉默的细胞注射到裸鼠皮下,与对照组相比LCAT1敲低的细胞成瘤能力明显下降。三、LCAT1敲低减少肺癌细胞的迁移和侵袭并且引起肺癌细胞G1期阻滞LCAT1敲低能够显著的降低肺癌细胞的迁移和侵袭,为了进一步探究LCAT1对肺癌细胞在体内的迁移能力,我们尾静脉注射对照组和敲低组的细胞到裸鼠体内,利用活体荧光成像系统我们发现在敲低LCAT1时肺癌细胞的迁移能力显著下调。另外,流式细胞术对细胞周期检测结果显示LCAT1敲低导致肺癌细胞发生G1期阻滞。四、LCAT1作为内源性竞争性结合的RNA吸附miR-4715-5p通过生物信息学软件预测LCAT1相互作用的miRNA,并通过荧光素酶报告载体检测显示,LCAT1可以结合miR-4715-5p。五、LCAT1通过抑制miR-4715-5p调控肺癌细胞的功能miR-4715-5p在肺癌细胞中的生物学功能还未知,我们通过实验证明miR-4715-5p过表达会抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等。当敲减LCAT1同时干扰miR-4715-5p表达会部分挽救由LCAT1敲低所造成细胞生长抑制。这些结果表明LCAT1功能至少部分是通过竞争性抑制miR-4715-5p实现的。六、RAC1(RAC family small GTPase 1)作为miR-4715-5p下游靶基因受到LCAT1间接调控荧光素酶报告载体实验和生物信息学分析显示RAC1是miR-4715-5p靶基因。在过表达miR-4715-5p时,RAC1蛋白水平和m RNA水平都显著下调。同样地,在LCAT1敲减的细胞中,RAC1蛋白和m RNA水平都明显降低。七、LCAT1通过内源竞争性结合miR-4715-5p来调控下游RAC1/PAK1(P21-activated kinase 1)的功能进而促进肺癌细胞的增殖和迁移通过对RAC1在肺癌细胞中的功能研究,我们发现RAC1能够促进细胞的增殖,而PAK1作为RAC1下游的直接效应分子,我们发现PAK1的磷酸化水平不论是在敲低RAC1还是在过表达miR-4715-5p以及敲减LCAT1的细胞中其蛋白表达水平都显著降低。八、RAC1小分子抑制剂提高改善紫杉醇对肺癌细胞的杀伤力紫杉醇作为肺癌临床治疗的一线药物,在肺癌治疗中有着重要的作用。我们发现RAC1小分子抑制剂EHop-016可以作为其佐剂来提高对肺癌细胞的杀伤。九、LCAT1与FUBP3(Far Upstream Element Binding Protein 3)相互作用在转录后水平调控c-Myc基因的表达通过RNA pull-down鉴定到与LCAT1相互结合的蛋白-FUBP3,FUBP3与LCAT1共同作用在转录后水平调控c-Myc基因的表达,从而促进肺癌的发生发展。总的来说,非编码RNA-LCAT1通过两种方式发挥促癌功能:一方面,LCAT1通过海绵吸附miR-4715-5p上调下游靶基因RAC1的表达,增强RAC1/PAK1信号通路,从而促进肿瘤的发生;另一方面,LCAT1与FUBP3结合促进C-Myc m RNA的翻译,进而促进肺癌发生发展。