近年来,化学发光用于生物活体成像技术得到发展,文献表明相关研究越来越受到关注。目前为止,尚缺乏适合用于活体分析的专用探针可能成为化学发光活体成像技术发展的最大制约。化学发光活体成像技术一个重要的发展方向是针对活体应用研究设计与合成专用的活体成像探针。新的发光探针应该具有以下特性:近中性条件下较高的化学发光效率和水溶性、发光波长尽可能贴近活体光学窗口、较长的体液稳定性和体内代谢时间。本文设计并合成了一类化学发光探针,其结构特点是:以环酰肼结构作为活性氧的响应基团,以高荧光量子产率的荧光素、罗丹明作为母体结构。通过理论计算分析这样的结构将具有较高的发光效率以及更长的发光波长。新探针含有-COOH、-OH强极性基团,预测其水溶性应有保障。这些特点对于化学发光活体成像分析都是十分有利的。本文第一章综述了化学发光及化学发光活体成像的基本原理、常用的发光探针及化学发光活体成像探针的研究现状。本文的主要研究内容共分为两部分:一、化学发光活体成像探针的合成及发光性质研究(1)5,6-二甲酰肼荧光素的合成。通过对荧光素和鲁米诺合成方法的总结提出了 5,6-二甲酰肼荧光素的合成路线,经过大量实验优化了合成条件,成功了合成并分离了 5,6-二甲酰肼荧光素,并对化合物进行了结构表征。(2)5,6-二甲酰肼荧光素的化学发光性质的研究。分别考察了 5,6-二甲酰肼荧光素的荧光光谱和荧光效率、化学发光光谱和相对化学发光效率,结果如下:①5,6-二甲酰肼荧光素的荧光效率较低,仅有6.01%,但是其发光体5,6-二甲酰肼荧光素的荧光效率较高,可达89.9%;②5,6-二甲酰肼荧光素的化学发光受pH的影响较大,随着pH的减小发光效率迅速减小,但是相对化学发光效率(鲁米诺为标准)却恰恰相反,在pH=7.4时,相对化学发光效率达到最大;③在模拟生理条件下(pH=7.4),5,6-二甲酰肼荧光素对H2O2、1O2、·O2-、HO·、ClO-等多种活性氧都有不同程度的响应,且与不同ROS反应的化学发光效率均比鲁米诺高;④5,6-二甲酰肼荧光素的发光波长523 nm,为黄绿色光。这些发光性质说明5,6-二甲酰肼荧光素具有成为优良的活体发光成像探针的潜质。(3)5,6-二甲酰肼罗丹明B的合成及发光性质研究。利用5,6-二甲酰肼荧光素的合成路线成功的合成了 5,6-二甲酰肼罗丹明B,并对化合物进行了结构表征。考察了 5,6-二甲酰肼罗丹明B的荧光性质和发光性质,发现其荧光光谱和荧光强度受pH值影响不大。研究了 NaClO为氧化剂时5,6-二甲酰肼罗丹明B的化学发光性质,发现5,6-二甲酰肼罗丹明B发光波长585 nm,说明该合成路线可以提供一类波长可调控的环酰肼类发光探针的合成方法;5,6-二甲酰肼罗丹明B的化学发光受pH影响较大:化学发光效率随pH的降低而降低,但是相对化学发光效率在pH=7.4时最大,此时5,6-二甲酰肼罗丹明B发光面积是鲁米诺的240倍;在pH=9.0时,5,6-二甲酰肼罗丹明B的最大发光强度最大。(4)5,6-二甲酰肼罗丹明110的合成及发光性质研究。利用5,6-二甲酰肼荧光素的合成路线成功合成了标记型的发光探针5,6-二甲酰肼罗丹明110,进一步验证了合成路线的可行性。考察了 5,6-二甲酰肼罗丹明B的荧光性质和发光性质,与5,6-二甲酰肼罗丹明B类似,其荧光光谱和荧光强度受pH值影响不大。化学发光效率随pH的降低而降低,但是相对化学发光效率在pH=7.4时最大,在pH=9.0时最大发光强度最大。二、5,6-二甲酰肼荧光素用于小动物活体成像的探索(1)5,6-二甲酰肼荧光素用于炎症的化学发光成像。实验发现5,6-二甲酰肼荧光素作为化学发光探针,对于裸鼠肌肉损伤引发的炎症、口腔炎症、化学物质接触导致的炎症都有较好的响应。利用化学接触性皮炎模型,在相同条件下比较了5,6-二甲酰肼荧光素和鲁米诺对于炎症检测的灵敏度,结果表明5,6-二甲酰肼荧光素用于检测化学接触性皮炎要比鲁米诺灵敏的多。(2)5,6-二甲酰肼荧光素用于催化剂标记的成像探索。5,6-二甲酰肼荧光素与过氧化氢反应的发光强度较弱,但其反应动力学曲线非常平缓,辣根过氧化物酶HRP可以作为5,6-二甲酰肼荧光素与过氧化氢反应的催化剂,从而增强其化学发光强度。又已知HRP广泛用于核酸、蛋白等分子的标记,考察了 HRP及HRP标记蛋白对裸鼠体内5,6-二甲酰肼荧光素成像信号的影响,探索化学发光活体成像在除活性氧检测以外的潜在应用价值。结果表明,5,6-二甲酰肼荧光素为发光探针可以实现裸鼠体内微量HRP的检测。