背景与目的肺癌是人类常见的恶性肿瘤之一。由于其难早发现、难早诊断,近三分之二的患者在诊断时即处于晚期。尽管近年来手术、放疗及化疗方案较前有很多改进,新的抗肿瘤药物不断涌现,但肺癌仍然位居世界肿瘤相关性死亡原因的首位。这种高死亡率大多是由肿瘤细胞的持续增殖能力和潜在的转移特性所造成,故对肿瘤增殖及凋亡调控机制的深入研究可能为临床延缓肿瘤进展提供重要治疗靶点。肺癌包括多种不同的病理亚型,包括非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,NSCLC),其中 NSCLC 占肺癌的85%以上。现普遍认为,蛋白质编码基因突变或拷贝数扩增(如EGFR,KRAS,FGFR1等)在NSCLC的发生发展中起关键作用。然而近年来,随着全基因组和转录组测序技术的广泛应用,长非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)在肿瘤发生的病理生理中的神秘面纱被逐渐揭开。LncRNAs是一类缺少有效开放阅读框,不编码蛋白质的,转录本长度超过200nt的RNA分子。既往文献已证实,lncRNAs作为新的调节因子参与多个细胞生物学过程,如细胞增殖,凋亡,迁移及肿瘤形成等,且lncRNAs的异常表达和功能异常均可导致人类多种肿瘤的发生。生长阻滞特异性转录本 5(the growth arrest-specific transcript 5,GAS5)转录于1号染色体长臂1q25,其包含12个外显子,全长约651 nt。GAS5最初是在生长阻滞的细胞中表达增高而被发现。后续研究发现,GAS5能和糖皮质激素反应元件(glucocorticoid response element,GRE)相互竞争结合糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR),从而抑制糖皮质激素相关基因的表达。此外,也有文献报道GAS5表达增高能诱导细胞周期进程减慢及凋亡增加,且GAS5在多种人类恶性肿瘤中表达降低。但其与NSCLC的相关性目前尚不清楚。本课题将首先通过对临床组织标本以及相关临床病理资料的分析明确GAS5表达水平与NSCLC之间的相关性。进一步在体外细胞实验和体内动物模型分别观察GAS5表达异常对NSCLC增殖和凋亡的影响,并探索其中可能的分子机制,为NSCLC的发病机制及治疗靶点提供新的理论依据。材料与方法1.收集手术切除后非小细胞肺癌组织及其配对正常肺组织标本72例,Trizol法提取RNA并逆转录为cDNA后,运用定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction,qRT-PCR)分别检测配对 NSCLC 组织及正常肺组织标本中GAPDH及GAS5表达水平。同时结合患者临床病理资料,利用统计学方法分析得出临床病理资料(如肿瘤结节大小、病理类型、TNM分期等)与GAS5表达水平之间的相关性。2.以人源支气管上皮细胞系(human bronchial epithelial cell,HBE)作为参照,利用qRT-PCR方法检测6种NSCLC细胞系中GAS5的基础表达水平。为探索GAS5表达失调的因素,在A549和H1650细胞系中加入不同浓度(0,5μM,10μM)5-氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-aza-CdR),72小时后收处理后细胞提取总RNA,并通过qRT-PCR方法观察各组中GAS5表达水平的变化。同时构建特异性抑制组蛋白修饰复合体多梳蛋白抑制复合物2(Polycomb repressive complex2,PRC2)亚单位 Zeste 同源序列 12 抑制子(The suppressor of zeste-12 protein,SUZ12)和 Zeste 同源序列 2 的增强子(The enhancer of zeste protein-2,EZH2)的siRNA,在A549细胞系中分别转染si-NC、si-SUZI2、si-EZH2,48小时后收细胞提取总RNA,并通过qRT-PCR方法观察各组中GAS5表达水平的变化。3.体外构建含GAS5全长序列的质粒pcDNA3.1-GAS5及特异性抑制GAS5的小干扰 RNA(short interfering RNA,siRNA)siRNA GAS5。根据 GAS5 在 6 种 NSCLC细胞系中的基础表达水平,GAS5表达较低的H1650细胞系和A549细胞系均转染过表达质粒pcDNA3.1-GAS5和pcDNA3.1,而GAS5基础表达水平较高的SPC-A1细胞系转染siRNA GAS5和si-NC。并运用qRT-PCR方法检测细胞中GAS5表达水平,验证其过表达及干扰效率。4.采用MTT方法和平板细胞克隆形成试验检测各处理组和对应对照组之间细胞增殖能力和细胞接种存活率的改变。利用PI法检测GAS5外源性表达增高对细胞周期进程的影响。通过流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)双重验证GAS5表达水平对细胞凋亡的影响。同时采用Matrigel基质胶有无的Transwell实验,观察GAS5过表达组及其对照组之间细胞迁移和侵袭能力的改变。并利用qRT-PCR和Western-blot方法初步探索GAS5影响NSCLC细胞系增殖能力和凋亡水平的可能原因。5.在BALB/c裸鼠中构建皮下肿瘤模型,共12只4周大雄性裸鼠,分为A549 pcDNA3.1组和A549 pcDNA3.1-GAS5组。每只裸鼠右侧腋窝皮下注射2×106个细胞,种植后3天开始观察肿瘤生长情况,每隔4天测量皮下瘤组织的最大径a及最小径b,根据体积=ab2/2公式计算得出每组肿瘤的大小,画出瘤体生长曲线,于2周后进行皮下瘤组织重量测量,最后统计分析。两组皮下瘤行Trizol法提取RNA,qRT-PCR检测GAS5表达水平,且同时,将瘤体固定切片利用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)和免疫组化方法检测增殖细胞相关的核抗原Ki-67染色。结果1.相较于正常对照组织,长非编码RNA GAS5表达水平在NSCLC组织标本中降低,并且与肿瘤大小、TNM分期具有相关性:在总共纳入的72名NSCLC患者中,65对NSCLC组织中GAS5表达水平较配对正常肺组织降低,其平均表达水平为0.578±0.594。结合临床病理资料分析发现36位肿瘤体积较大(最大径>5cm)患者的GAS5表达水平较36位肿瘤体积较小(最大径＜5cm)患者低(P=0.0065)。根据qRT-PCR结果将NSCLC患者分为GAS5高表达组和低表达组。统计学分析发现GAS5表达高低与肿瘤大小及TNM分期具有明显相关性(P=0.014及P=0.013)。提示GAS5可能是潜在的NSCLC的诊断标志物。2.DNA甲基化水平改变可能是GAS5表达下调的潜在因素:经过qRT-PCR检测结果显示在 6 种 NSCLC 细胞系中,A549、H1299、H1650、H1975、SK-MES五种NSCLC细胞系中GAS5表达量较HBE细胞系中低,而SPC-A1细胞系中GAS5表达量较高。进一步探索导致GAS5表达异常因素的实验中,qRT-PCR结果显示在A549和H1650细胞系中,加入不同浓度5-aza-CdR(0,5μM,10μM)后GAS5表达水平显示增加,且呈浓度依赖性(P<0.05)。而在干扰PRC2亚单位SUZ12和EZH2后,GAS5表达水平无明显变化(P>0.05)。这提示GAS5启动子区CpG岛DNA甲基化水平增高可能是GAS5在NSCLC组织和细胞系中表达降低的潜在因素。3.GAS5表达增高可转录后调控P53和E2F1,抑制NSCLC细胞增殖,促进NSCLC细胞凋亡:根据qRT-PCR结果,选择A549和H1650细胞系行过表达实验,SPC-A1细胞系行干扰实验。MTT实验结果显示,相较于对照组细胞,A549和H1650细胞系过表达GAS5后细胞的增殖速度减慢(P<0.05),而SPC-A1细胞系中干扰GAS5表达后细胞增殖速度较对照组细胞增加(P<0.05)。平板克隆实验中,GAS5表达增高后细胞形成的克隆无论数目还是大小均较对照组低(P<0.05),而GAS5干扰组克隆形成能力较对照组细胞明显增加(P<0.05)。提示GAS5具有降低细胞群体依赖性和增殖能力的作用。同时流式技术检测A549和H1650细胞周期进程结果显示,GAS5表达增高的细胞呈现明显的细胞周期G1/G0期阻滞,增殖速率变慢(P<0.05)。流式技术检测A549和H1650细胞系凋亡结果显示,增加GAS5表达量可明显增加凋亡细胞数量,尤其是早凋细胞的数量(P<0.05)。TUNEL对凋亡细胞的核DNA中产生的3’-OH末端进行原位标记,结果同样显示,相较于对照组,GAS5过表达组荧光标记率较高(P<0.05)。而Transwell实验结果显示,与对照组细胞相比,A549细胞系过表达GAS5后迁移细胞数和侵袭细胞数均无明显变化(P>0.05)。Western blot检测GAS5表达增高后可能调控的下游分子结果显示与对照组相比,GAS5表达增高后抑癌基因P53表达水平及其下游靶基因P21升高而转录因子E2F1和细胞周期蛋白cyclinD1表达水平下降(P<0.05),但qRT-PCR检测两组P53和E2F1 mRNA的变化显示GAS5不能使P53和E2F1 mRNA表达水平改变(P>0.05)。此外,对既往已报道的GAS5下游调控分子进行qRT-PCR检测发现细胞凋亡抑制因子2(cellular inhibitor of apoptosis 2,cIAP2)和血清/糖皮质激素调节激酶 1(serum/glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)表达水平无明显变化(P>0.05)。4.GAS5表达增高可抑制NSCLC成瘤性:2周后GAS5表达增高组的皮下瘤结节体积较对照组小(0.0323cm3 vs 0.727cm3,P=0.00048),肿瘤重量也较低(0.085g vs0.457g,P=0.00118)。QRT-PCR检测瘤体GAS5表达水平显示,GAS5过表达组皮下瘤体组织中GAS5表达水平是对照组22.7倍(P<0.05)。随后对两组皮下瘤组织行HE和Ki-67染色结果显示与对照组相比,GAS5过表达组Ki-67阳性率较对照组明显降低。上述活体动物水平实验结果证实GAS5能显著抑制NSCLC细胞的肿瘤形成能力。结论与意义1.GAS5表达缺失是NSCLC发生发展过程中的重要因素,GAS5可能为潜在的NSCLC诊断分子标志物:临床标本检测提示GAS5表达与NSCLC患者肿瘤大小、TNM分期相关,其表达降低是NSCLC发生发展的重要因素。由于GAS5在晚期NSCLC患者组织标本中表达量较早期患者低,故其也可能是潜在的NSCLC诊断分子标志物。2.GAS5证实通过转录后调控抑癌基因P53和转录因子E2F1表达水平,抑制NSCLC细胞增殖,促进NSCLC细胞凋亡:GAS5表达增高后体外能通过P53依赖和非依赖途径有效的增加NSCLC细胞G1期阻滞,抑制NSCLC细胞增殖和克隆形成能力且增加细胞凋亡,从而发挥抑癌基因的功能。这为阐明NSCLC分子机制提供了新的理论基础。3.通过体内实验证实GAS5抑制裸鼠皮下瘤生长:GAS5表达增高后明显抑制裸鼠皮下种植肿瘤的生长,降低瘤体重量和Ki-67阳性率。这为抑制NSCLC增殖提供新的有效治疗靶点,具有临床转化和产业化前景。