目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者常见的微血管并发症,是终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因之一,给社会和家庭带来沉重负担。现代医学尚缺乏有效的延缓糖尿病肾病发生发展的方案。中医药是我国临床医疗的一大特色,近年来在治疗肾脏疾病方面取得了很好的疗效。目前多数中医肾病专家认为,糖尿病肾病的基本病机除糖尿病原有的“气阴两虚”外,“瘀血阻络”可能是该病病机之关键。经临证反复筛选,化瘀通络中药已成为我们治疗糖尿病肾病遣方用药的重要组成部分。蛋白尿是糖尿病肾病早期最重要的临床表现。现代医学证实,原尿的形成必须通过肾小球的内皮细胞、基底膜(glomerular basement membrane,GBM)和足细胞,这三层结构称为肾小球滤过屏障。肾小球滤过屏障具有分子屏障和电荷屏障功能,任一屏障功能损伤均会产生蛋白尿。正常状态下,带阴电荷的血浆白蛋白几乎完全不能通过肾小球滤过屏障,而当滤过屏障阴电荷减少时,即使其结构完整,也会出现蛋白尿。本研究拟通过瘀血阻络证相关实验室指标检测及DN肾损伤相关检测验证化瘀通络中药治疗DN的合理性及有效性,并通过体内及体外实验探讨化瘀通络中药对DN蛋白尿的治疗作用是否与保护肾小球电荷屏障有关,以及化瘀通络中药不同配伍对DN作用的差异。方法:1化瘀通络中药及其不同配伍对糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证相关实验室指标的干预作用75只SD大鼠适应性喂养1周,随机选取10只做为正常对照组(C组),其余大鼠予高糖高脂饲料喂养,4周后造模大鼠按照35mg/kg腹腔注射1%链脲佐菌素(streptozocin,STZ),72小时后测随机血糖≥16.7mmol/L者为糖尿病造模成功。将成模大鼠60只随机分为模型组(M组)15只,全方组(Q组,由丹参、川芎、地龙、水蛭、全蝎组成)15只,化瘀组(h组,由丹参、川芎组成)15只,通络组(t组,由地龙、水蛭、全蝎组成)15只。造模成功后开始给药,中药给药量:丹参1.35g/kg、川芎1.08g/kg、地龙0.9g/kg、水蛭0.54g/kg、全蝎0.54g/kg;正常对照组及模型组给予等量饮用水灌胃。每日1次,共16周。第16周末大鼠尾静脉取血,检测糖化血红蛋白(hemoglobina1c,hba1c)。麻醉状态下腹主动脉取血,检测血糖、血脂、血常规、血凝,并留取血液elisa法检测血管性血友病因子(vonwillebrandfactor,vwf)、血小板α颗粒膜糖蛋白cd62p含量。2化瘀通络中药及其不同配伍对糖尿病肾病大鼠肾损伤的干预作用90只sd大鼠适应性喂养1周,随机选取10只做为正常对照组(c组),其余大鼠造模方法同前。将成模大鼠74只随机分为模型组(m组)15只,厄贝沙坦组(irbesartan,i组)14只,全方组(q组)15只,化瘀组(h组)15只,通络组(t组)15只,干预方法同前。注射stz72h后(0周)及给药第2、4、8、12、16周末记录各组大鼠进食量,饮水量,代谢笼收集大鼠24h尿液,elisa法检测尿蛋白浓度。第16周末,大鼠称体重,麻醉后腹主动脉取血,检测肝肾功能;取出右肾称重,将部分肾组织分别放入faa固定液和4%戊二醛固定液中,待行光镜和透射电镜病理学检测。3化瘀通络中药及其不同配伍对糖尿病肾病大鼠肾小球电荷屏障的干预作用90只sd大鼠造模及干预方法同前。第16周末留取大鼠随机尿,麻醉大鼠后,腹主动脉取血,留取肾皮质冻存,采用real-timepcr,westernblot检测肾组织hspg、hpa、pcx、glepp1表达;取部分肾皮质置于4%中性甲醛固定液中,待行免疫组织化学检测;将右肾下极浸泡在阳离子示踪剂0.5%聚乙烯亚胺(polyethylenimine,pei)中,透射电镜检测gbm阴离子位点(anionicsites,as)。4化瘀通络中药对高糖环境下足细胞电荷屏障相关蛋白的干预作用33℃、含γ-干扰素dmem-f12完全培养基培养小鼠足细胞,当足细胞增殖至足够数量时,更换为不含γ-干扰素的培养基,置于37℃培养箱使细胞分化。依照mtt法筛选出的化瘀通络中药含药血清最佳浓度,将足细胞分为正常糖组(ng组)、高糖组(hg组)、高渗组(mg组)和中药组(zg组)。各组分别给予相应干预24h、48h、72h后,收集细胞,采用免疫细胞化学及real-timepcr,westernblot检测足细胞pcx、glepp1表达。结果:1化瘀通络中药及其不同配伍对糖尿病肾病大鼠瘀血阻络证相关实验室指标的干预作用1.1大鼠一般情况注射stz72h内造模大鼠死亡3只,2只血糖不达标,予以剔除。灌胃16周内,m组、q组、h组各有3只,t组2只大鼠血糖自行恢复,予以剔除;各组大鼠死亡情况为c组1只,m组5只,q组3只,h组4只、t组3只。1.2糖化血红蛋白检测c组大鼠hba1c均<3.0%;与c组相比,造模各组hba1c均升高;造模各组之间hba1c无统计学差异(p≥0.05)。1.3空腹血糖、血脂检测与c组相比,造模各组fbg均显著升高(p<0.01);造模各组之间fbg无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,造模各组cho均显著升高(p<0.01);造模各组之间cho无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组tg升高(p<0.01);与m组相比,q组、h组、t组tg均下降(p<0.05);q组、h组、t组之间无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组hdl-c升高(p<0.01);与m组相比,q组、h组hdl-c无统计学差异(p≥0.05),t组hdl-c下降(p<0.05)。与c组相比,m组ldl-c升高(p<0.01);与m组相比,q组、t组ldl-c下降(p<0.05),h组无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组vldl-c升高(p<0.01);与m组相比,q组、h组、t组vldl-c均下降(p<0.01或0.05);与q组相比,h组、t组vldl-c均升高(p<0.05)。1.4血小板参数检测各组plt无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组mpv增大(p<0.05);与m组相比,q组、h组、t组mpv减小(p<0.05);q组、h组、t组之间无统计学差异(p≥0.05)。各组pct无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组pdw增大(p<0.05);与m组相比,q组pdw减小(p<0.05),h组、t组无统计学差异(p≥0.05)。1.5血凝检测与c组相比,m组大鼠pt明显缩短(p<0.01),q组、t组较m组延长(p<0.05);与c组相比,各组大鼠inr均明显降低(p<0.01),各组之间无统计学意义(p>0.05);与c组相比,m组大鼠aptt明显缩短(p<0.01),q组较m组延长(p<0.05);各组大鼠tt无统计学意义(p>0.05);与c组相比,造模各组大鼠fib水平升高(p<0.05),造模各组之间无统计学意义(p>0.05);与c组相比,m组大鼠at-iii活性明显降低(p<0.01),q组、h组、t组较m组升高(p<0.05)。1.6elisa检测血浆vwf、cd62p含量与c组相比,m组大鼠血浆vwf明显升高(p<0.01),q组、h组、t组较m组降低(p<0.05),q组、h组、t组之间无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组大鼠血浆cd62p含量明显增多(p<0.01);与m组相比,q组、h组、t组减少(p<0.05);与q组相比,h组增多,t组无统计学差异(p≥0.05)。2化瘀通络中药及其不同配伍对糖尿病肾病大鼠肾损伤的干预作用2.1大鼠一般情况与同时间点c组相比,造模各组大鼠进食量、饮水量、尿量均显著增加(p<0.01);造模各组之间无统计学差异(p≥0.05)。2.2 24小时尿蛋白定量(24hupe)检测dm成模3天后检测各组大鼠24hupe无统计学差异(p≥0.05)。第2周末与同时间点c组相比,m组24hupe升高(p<0.05);与同时间点m组相比,i组、q组降低(p<0.05)。第4周末与同时间点c组相比,造模各组24hupe均升高(p<0.01或0.05);与同时间点m组相比,i组、q组降低(p<0.05)。第8周末与同时间点c组相比,造模各组24hupe均升高(p<0.01或0.05);与同时间点m组相比,各治疗组降低(p<0.05)。第12、16周末与同时间点c组相比,造模各组24hupe均显著升高(p<0.01);与同时间点m组相比,各治疗组降低(p<0.05);与同时间点i组相比,q组降低(p<0.05);与同时间点q组相比,h组、t组升高(p<0.05)。2.3肝功能、肾功能检测各组大鼠tp、alb无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组scr显著升高(p<0.01);与m组相比,q组降低(p<0.05),i组、h组、t组无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,造模各组bun均显著升高(p<0.01);造模各组之间bun无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组ua显著升高(p<0.01);与m组相比,q组、t组降低(p<0.05),i组、h组无统计学差异(p≥0.05)。2.4体重、肾重及肾脏肥大指数(ki)比较造模各组大鼠体重均显著低于c组(p<0.01);造模各组之间无统计学差异(p≥0.05)。各组大鼠肾重无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,造模各组ki均显著升高(p<0.01);与m组相比,q组、t组降低(p<0.05),i组、h组无统计学差异(p≥0.05)。2.5光镜观察结果c组大鼠肾组织结构正常;m组大鼠肾小球肥大,肾小囊呈裂隙状,甚至出现球囊粘连,肾小球基底膜明显增厚,系膜基质增生,系膜区增宽;与m组相比,各治疗组病理改变减轻;各治疗组间比较,h组病理表现略重于其它三组。2.6透射电镜观察结果c组大鼠肾组织结构清晰;m组肾小球基底膜均质增厚,足细胞足突融合,系膜基质增生。与m组比较,各治疗组病理改变减轻;各治疗组间比较,h组病理表现略重于其它三组。与c组相比,m组肾小球基底膜显著增厚(p<0.01);与m组相比,各治疗组肾小球基底膜增厚均减轻(p<0.01或0.05);各治疗组之间比较,h组增厚程度重于其它三组(p<0.05)。3化瘀通络中药及其不同配伍对糖尿病肾病大鼠肾小球电荷屏障的干预作用3.1real-timepcr检测肾组织hspg,hpa,pcx,glepp1mrna表达各组大鼠肾组织hspgmrna表达无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组hpamrna表达显著增多(p<0.01);与m组相比,i组、q组、t组减少(p<0.05),h组无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组pcxmrna表达减少(p<0.05);与m组相比,i组、q组增多(p<0.05),h组、t组无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组glepp1mrna表达减少(p<0.05);与m组相比,各治疗组均无统计学差异(p≥0.05)。3.2免疫组织化学法检测肾组织hspg,hpa,pcx,glepp1蛋白表达hspg主要分布于肾小球基底膜和系膜基质,各组大鼠肾组织hspg核心蛋白表达量无明显差异。hpa在c组大鼠肾小球无明显表达,在肾小管上皮细胞呈低表达;与c组相比,hpa在m组大鼠肾小管上皮细胞表达明显增加,并且在肾小球内皮细胞表达;与m组相比,i组、q组、t组hpa表达均减少,h组无明显差异。pcx,glepp1是足细胞的特异性蛋白。与c组相比,m组pcx,glepp1表达减少;与m组比较,i组、q组pcx,glepp1表达增多,h组、t组无明显差异。3.3westernblot检测肾组织hpa,pcx,glepp1蛋白表达与c组相比,m组hpa蛋白表达显著增多(p<0.01);与m组相比,i组、q组、t组减少(p<0.05),h组无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组pcx蛋白表达减少(p<0.05);与m组相比,i组、q组增多(p<0.05),h组、t组无统计学差异(p≥0.05)。与c组相比,m组glepp1蛋白表达减少(p<0.05);与m组相比,i组、q组增多(p<0.05),h组、t组无统计学差异(p≥0.05)。3.4elisa检测各组大鼠尿pcx含量与c组相比,m组大鼠尿pcx含量显著增多(p<0.01);与m组相比,各治疗组尿pcx含量均减少(p<0.05);各治疗组之间比较,i组、q组、t组尿pcx含量少于h组(p<0.05)。3.5透射电镜检测肾小球基底膜阴离子位点与c组相比,m组大鼠gbm上阴离子位点显著减少(p<0.01);与m组相比,i组、q组、t组as增多(p<0.05),h组无统计学差异(p≥0.05)。4化瘀通络中药对高糖环境下足细胞电荷屏障相关蛋白的干预作用4.1足细胞鉴定分化成熟的足细胞呈树枝状,细胞核表达足细胞特异性蛋白wt-1。4.2mtt法筛选最佳药物浓度与同时间点ng组相比,hg组od值均明显降低(p<0.01),mg组无统计学差异(p>0.05)。与同时间点hg组相比,24h后各给药组od值均升高(p<0.05),但不同含药血清浓度之间无统计学差异(p>0.05);48h、72h后5%、10%、15%含药血清组od值高于2.5%含药血清组(p<0.05),且5%、10%、15%含药血清组之间无统计学差异(p>0.05)。故以5%含药血清浓度用于后续实验。4.3免疫细胞化学法检测足细胞pcx、glepp1蛋白表达免疫细胞化学结果显示pcx、glepp1均表达于足细胞膜,ng组与mg组pcx、glepp1表达无明显差异;与ng相比,hg组pcx、glepp1表达均明显减少;与hg组相比,zg组pcx、glepp1表达均有所增加。4.4real-timepcr检测足细胞pcx、glepp1mrna表达ng组与mg组pcxmrna表达无统计学差异(p≥0.05);与同时间点ng组相比,hg组pcxmrna表达明显减少(p<0.01);与同时间点hg组相比,zg组pcxmrna表达增加(p<0.01)。ng组与mg组glepp1mrna表达无统计学差异(p≥0.05);与同时间点ng组相比,hg组glepp1mrna表达明显减少(p<0.01);与同时间点hg组相比,含药血清干预24h,48h后glepp1mrna表达无统计学差异(p≥0.05),含药血清干预72h后glepp1mrna表达增加(p<0.05)。4.5westernblot检测足细胞pcx、glepp1蛋白表达ng组与mg组pcx蛋白表达无统计学差异(p≥0.05);与同时间点ng组相比,hg组pcx蛋白表达减少(p<0.05);与同时间点hg组相比,含药血清干预24h后pcx蛋白表达无统计学差异(p≥0.05),含药血清干预48h、72h后pcx蛋白表达增加(p<0.05)。ng组与mg组glepp1蛋白表达无统计学差异(p≥0.05);与同时间点ng组相比,hg组glepp1蛋白表达明显减少(p<0.01);与同时间点hg组相比,zg组glepp1蛋白表达增加(p<0.01)。结论:1以高糖高脂饲料联合小剂量stz复制的糖尿病大鼠模型制备成功后逐渐出现蛋白尿及DN肾脏病理学改变。且模型大鼠存在脂代谢紊乱,血管内皮损伤,血小板异常活化,血液处于高凝状态,符合中医瘀血阻络证改变。2化瘀通络中药及其不同配伍能改善DN大鼠瘀血阻络状态,并能减少DN大鼠尿蛋白,减轻肾脏病理损伤,延缓肾脏病进展,与厄贝沙坦作用相似。3化瘀通络中药及其不同配伍减少DN大鼠尿蛋白的作用机制可能与其抑制肾脏HPA过表达,上调足细胞PCX、GLEPP1表达,维持肾小球电荷屏障完整性有关。4体外实验也证实与高糖培养的足细胞相比,高糖加5%化瘀通络中药含药血清干预能上调PCX、GLEPP1表达,减少足细胞表面阴电荷丢失。5综合分析,化瘀中药与通络中药都有一定的改善DN瘀血阻络证的作用,通络中药对于肾脏的保护作用优于化瘀中药。化瘀通络中药全方优于化瘀中药与通络中药单独应用,化瘀中药与通络中药联合应用可产生协同作用。