微小核糖核酸（micro ribonucleic acid, miRNA）作为一种小分子调节物质，特异性表达于血管内皮细胞（vascular endothelial cell, VEC）。它能够通过特异性结合于靶mRNA （messager ribonucleic acid）3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）阻止靶mRNA的翻译过程或降解靶mRNA，参与VEC形态结构与功能的维持与调节，在血管病理生理过程中发挥重要的调控功能。研究发现，microRNA-126（miR-126）在心血管系统中具有特异性表达，参与VEC炎症性损伤与修复过程。miR-126表达水平的下调能够促进肿瘤坏死因子-α （tumor necrosisfactor-alpha, TNF-α）诱导的血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）表达上调，促进单核细胞（monocyte, MC）向VEC黏附；然而，miR-126前体过度表达而上调其表达水平，能够降低VCAM-1表达。因此，miR-126具有重要的基因表达调控功能，通过调节VCAM-1的表达干预MC向VEC黏附过程，从而阻止动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）炎症反应的发生与发展。丹皮酚（paeonol, Pae）是毛茛科植物牡丹Paeonia Suffruticosa Andr.的干燥根皮及萝摩科植物徐长卿Cynanchum Paniculatum （Bge.） Kitag.的干燥根及根茎有效成分之一，具有抗心律失常、抗高血压、抗血栓等广泛的心血管系统药理作用。课题组前期研究表明，Pae具有显著抗鹌鹑实验性AS和保护高脂血症大鼠VEC作用，抑制高脂血症大鼠的血清和主动脉等脂质过氧化反应，对健康人体血清ox-LDL体外氧化修饰反应也具有抑制作用。在氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）诱导VEC炎症性损伤过程中，Pae能够降低磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K）、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶（protein-serine-threonine kinase, Akt）和核因子-κB （nuclear factor-κappa B,NF-κB）等信号蛋白磷酸化水平而阻断细胞炎症性信号通路的转导，阻止VCAM-1等细胞黏附因子的表达与释放、MC向VEC黏附和VEC的增殖与迁移等炎症性反应，从而遏制AS形成与发展的过程。目的探讨miR-126在ox-LDL诱导的VEC炎症反应过程中特异性表达，并验证其调控的靶基因VCAM-1的表达，以及对MC与VEC黏附功能的影响；研究Pae调节miR-126表达及其对PI3K/Akt/NF-κB信号蛋白磷酸化与通路转导的影响，以探讨Pae抗AS的作用靶点及分子机制。方法用预消化-贴壁的方法从大鼠胸主动脉分离和培养原代VEC，并用免疫细胞化学技术鉴定所获得的VEC；用MTT方法检测ox-LDL对VEC活性的影响和台盼蓝染色方法检测ox-LDL刺激细胞膜通透性的变化；用实时定量SYBR GreenPCR技术检测miR-126、VCAM-1mRNA的表达；用Western blotting技术检测VCAM-1蛋白的表达；用HiPerFect试剂将miR-126mimic或inhibitor转染进入VEC后；用双荧光素酶报告系统验证miR-126表达调控的靶基因VCAM-1；用孟加拉玫瑰红试剂检测MC与VEC的黏附功能。用MTT方法检测Pae对ox-LDL损伤VEC的保护作用，并检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）的释放；用HiPerFect试剂将miR-126mimic或inhibitor转染进入VEC后，用实时定量SYBR Green PCR技术检测Pae对miR-126、VCAM-1mRNA在ox-LDL诱导VEC中表达的影响，并用Westernblotting方法检测VCAM-1蛋白和PI3K、Akt、p65、IκB等信号蛋白的表达变化；用孟加拉玫瑰红试剂检测Pae通过miR-126表达对MC与VEC黏附功能的影响。结果1miR-126在ox-LDL诱导大鼠VEC中呈低表达miR-126在ox-LDL (20mg·L^-1)刺激的VEC炎症性损伤中，具有明显的低表达（P<0.01）。2miR-126在大鼠VEC中调控的直接靶点是VCAM-1miR-126能够调控VCAM-1基因3’UTR：miR-126mimic促进miR-126的高表达，作用于VCAM-1mRNA3’UTR野生型质粒，明显降低萤火虫荧光素酶的活性（P<0.05）；当miR-126高表达作用于VCAM-1mRNA3’UTR突变型质粒，萤火虫荧光素酶的活性无差异性。3miR-126对MC向VEC黏附功能的影响ox-LDL (20mg·L^-1)模型对照组吸光度（absorbance, A）值相比较空白对照组具有明显升高（P<0.01），MC与VEC黏附功能明显增强；转染miR-126mimic组A值与ox-LDL对照组比较具有明显降低（P<0.01）。4Pae对ox-LDL损伤VEC中miR-126表达的影响miR-126在ox-LDL (20mg·L^-1)模型组中的表达明显降低（P<0.01）。miR-126在Pae （60μM）组的表达明显上调（P<0.05），在Pae （120、240μM）组也具有显著的高表达（P<0.01）。Pae能够明显的促进miR-126mimic诱导的miR-126高表达（P<0.05）；Pae与miR-126inhibitor组中的miR-126表达水平明显下调。5Pae上调miR-126对ox-LDL诱导VEC中VCAM-1表达的影响VCAM-1在ox-LDL (20mg·L^-1)对照组中的表达具有升高的趋势。Pae （120μM）能够明显降低VCAM-1表达的作用（P<0.05）；VCAM-1在转染miR-126mimic组中的表达具有显著的降低（P<0.01）。VCAM-1在转染miR-126inhibitor组中的表达水平具有明显的上调。6Pae上调miR-126对ox-LDL诱导VEC中PI3K/Akt通路的影响PI3K和Akt信号蛋白在ox-LDL (20mg·L^-1)对照组中磷酸化水平具有明显的升高。Pae能够明显降低ox-LDL诱导PI3K和Akt蛋白的磷酸化水平。PI3K在转染miR-126mimic组中的磷酸化水平具有明显的下调（P<0.05），抑制Akt蛋白的磷酸化（P<0.01）。7Pae上调miR-126对ox-LDL诱导VEC中NF-κB通路的影响NF-κB抑制蛋白（inhibitory kappa B, IκB）在ox-LDL (20mg·L^-1)对照组中的磷酸化水平具有明显上调的趋势。Pae能够明显降低ox-LDL诱导IκB的磷酸化水平，下调p65蛋白的表达。IκB蛋白在转染miR-126mimic组中磷酸化水平具有明显下调的趋势（P<0.05），在转染miR-126inhibitor组中磷酸化水平具有明显上调的趋势（P<0.01）。LY294002作为PI3K/Akt信号通路的阻断剂，能够抑制磷酸化IκB蛋白的表达，下调p65蛋白的表达水平，表明NF-κB是PI3K/Akt下游信号蛋白。8Pae上调miR-126对MC向ox-LDL损伤的VEC黏附功能的影响ox-LDL (20mg·L^-1)对照组明显升高MC与VEC的黏附功能（P<0.05）。Pae能够明显降低ox-LDL诱导的MC黏附于VEC数量（P<0.05），转染miR-126mimic组MC与VEC的黏附功能明显降低（P<0.01）。结论1. miR-126在ox-LDL诱导的大鼠VEC炎症性反应中具有特异性低表达；VCAM-1为miR-126负调控的靶基因；在ox-LDL诱导的大鼠VEC中，因miR-126表达降低而上调VCAM-1的表达与释放并增强MC与VEC黏附功能。2. Pae能够促进ox-LDL诱导的VEC表达miR-126；抑制VCAM-1表达与释放；Pae上调miR-126表达可阻断PI3K/Akt/NF-κB信号通路的转导，降低MC向VEC的黏附。