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目的:观察Lactacystin诱导神经元样PC12细胞炎症因子COX-2和PGE2的影响,探讨独活香豆素对帕金森病模型细胞保护的作用机制。材料与方法:1.制备含药血清:将实验动物50只大鼠应用随机法分为四组,正常组20只,吐温80组、塞来昔布组、独活香豆素组各10只。每日8:00-10:00灌胃给药,给药情况为,正常组:生理盐水。吐温80组:0.08%吐温80灌胃,2ml/次/只。塞来昔布组:20mg/kg。独活香豆素组;0.08%吐温80助溶[12],155mg/kg。连续灌胃7天。末次灌胃2h后腹主动脉处取血。静置2h后,2000r/min离心10min,使分离血清。56℃灭活30min,0.22μm滤膜过滤灭菌。-20℃冰箱待用。2.PC12细胞传代与培养:购买后未分化的PC12细胞经NGF诱导转变为神经元样PC12细胞,取进入对数生长期的细胞,用含15%马血清细胞培养基,在96孔板中培养,100μl体系,密度为1×105/ml,24h后细胞呈贴壁生长状态。3.确定Lactacystin作用浓度:取Lactacystin母液1mmol/l,稀释为四组浓度。稀释后加入细胞培养基中24h。培养后应用MTT检测细胞相对存活率。4.确定含药血清作用浓度及时间:取神经元样PC12细胞其生长周期为对数生长期,接种于密度为1×105/ml的96孔板中,100μl体系,24h,待贴壁生长后。将96孔板分为16个部分,并划分为不同组,实验细胞分组情况:正常血清对照组、模型组、吐温80血清组、塞来昔布血清组、独活香豆素血清组。将除空白组外各实验组更换培养基,其浓度分为10%、15%、20%,并设置每组3个复孔。培养时间分别为24h。将除空白对照组和正常血清对照组外各实验组分别加入5μmol/L Lactacystin作用24h;应用MTT检测细胞相对存活率,确定最佳含药血清浓度和作用时间。5.正式实验:将实验细胞分为5组,分组情况:正常血清对照组、模型组、吐温80血清组、塞来昔布血清组、独活香豆素血清组。按照上述已确定的含药血清和Lactacystin浓度和作用时间,分别加入15%各实验组含药血清,保护24h,再加入5%Lactacystin,造模24h。6.指标检测及统计学处理:应用MTT检测法检测各实验组的细胞活性。应用ELISA检测法检测细胞上清液中炎症因子COX-2和PGE2的蛋白表达。应用SPSS 25.0统计软件对实验结果进行分析统计,以p<0.05为有统计学差异。结果:1.确定Lactacystin的作用浓度将浓度分别为0、5、10、20μmol/l的Lactacystin,作用于神经元样PC12细胞24h,应用MTT法测定其吸光度值,并与空白对照组(0μmol/l)进行比较,结果发现,随着Lactacystin浓度的增加,细胞相对存活率逐渐下降且有剂量依赖性。与空白对照组相比,5、10、20μmol/l各组细胞相对存活率均显著降低且差异显著(P<0.01);且当Lactacystin的浓度不小于10μmol/l时,细胞相对存活率下降尤甚。据此,最后确定浓度为5μmol/l的Lactacystin,作用时间24h,为神经元样PC12细胞损伤的刺激条件。2.确定含药血清作用时间和浓度通过比较各浓度组的OD值和相对存活率结果发现,无论24小时还是48小时,均以浓度为15%的正常血清对照组的OD值和相对存活率更接近于空白对照组。为了达到实验的浓度更加优化和实验的时间更加节约化的目的,最终确定含药血清浓度为15%、作用时间为24小时,为神经元样PC12细胞损伤的保护条件。3.确定各实验组血清对细胞活性的影响分化好的神经元样PC12细胞,予以确定浓度和时间的含药血清和Lactacystin(正常血清对照组不加)分别作用24h,应用MTT法检测,结果发现:模型组与吐温80血清组之间无统计学差异(p>0.05);模型组和吐温80血清组细胞OD值显著低于正常血清对照组(p<0.01);独活香豆素血清组细胞OD值显著高于模型组和吐温80血清组和塞来昔布血清组,但低于正常血清对照组(均p<0.01);塞来昔布血清组细胞OD值高于模型组和吐温80血清组,低于正常血清对照组和独活香豆素血清组(均p<0.01)。4.各实验组含药血清对Lactacystin诱导神经元样PC12细胞上清液COX-2和PGE2蛋白表达的影响应用MTT检测法结果发现:模型组与吐温80血清组无统计学差异(p>0.05);模型组和吐温80血清组细胞上清液中COX-2和PGE2的含量显著高于正常血清对照组(p<0.01);独活香豆素血清组细胞上清液中COX-2和PGE2的含量显著低于模型组、吐温80血清组和塞来昔布血清组,但高于正常血清对照组(均p<0.01);塞来昔布血清组细胞上清液中COX-2和PGE2蛋白的含量低于模型组和吐温80血清组,但高于正常血清对照组和独活香豆素血清组(均p<0.01)。结论:1.本实验应用Lactacystin蛋白酶体抑制剂,作用于神经元样PC12细胞。成功模拟帕金森病细胞损伤模型。2.独活香豆素含药血清能促进Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞增殖,且效果好于塞来昔布血清组。独活香豆素含药血清对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞具有保护作用。3.独活香豆素含药血清能够降低模型细胞上清液炎症因子COX-2和PGE2蛋白的表达,从而具有抑制炎症的作用,这可能是其保护神经元样PC12细胞的作用机制,且效果好于塞来昔布血清组。4.神经元样PC12细胞损伤的刺激条件:浓度为5μmol/l的Lactacystin、作用时间24h。5.神经元样PC12细胞损伤的保护条件:含药血清浓度为15%、作用时间24h。