研究背景脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)在临床上一般指代自发性脑出血,是由各种原因造成的脑血管破裂,导致脑组织内或脑室内出血。外伤和肿瘤导致的脑出血一般不归入临床脑出血的范畴,亦不是本研究讨论的对象。脑出血是出血性卒中(hemorrhagic stroke)里发病率最高的类型,也是致死率和致残率最高的类型。全球脑出血的平均发病率是2.5人/万人,其中45%在急性发病后1个月内死亡,35%的患者幸存后遗留严重的终身残疾,即总体病死病残率高达80%以上,可见其严重性。脑出血在世界范围内已成为公共卫生部门的严峻挑战,在以中国为首的发展中国家,其发病率和患病率逐渐增高,正给民众的生命和财产安全带-来严重威胁,危害社会稳定。既往对脑出血的研究将血肿的机械损伤和由此带来的血肿周围半暗带视为脑出血后脑损伤的根本原因,因此不论基础还是临床研究都聚焦于如何清除血肿,减小半暗带的范围。但经过长时间的实践后发现,这并不能显著改善脑出血病人的预后。近年来,部分学者通过研究脑出血的病理生理机制,提出脑出血后脑损伤可以划分为原发性脑损伤(primary brain injury,PBI)和继发性脑损伤(secondary brain injury,SBI),前者即传统观念认为的血肿直接导致的损伤,后者是血肿诱导发生的一系列病理过程和损伤的集合,包括免疫损伤、铁离子毒性、谷氨酸兴奋性毒性、细胞自噬、自由基损伤、炎症反应、神经元凋亡、脑白质损伤等。近年来的几项多中心随机对照试验结果大都证实血肿清除术相对于保守治疗而言并没有明显改善自发性脑出血病人的预后,提示由出血导致的继发性脑损伤才是影响预后的关键因素。而且在细胞及动物实验中,已有不少研究证实,减轻脑出血后的继发脑损伤对脑出血后神经功能缺损有保护作用。因此最新的脑出血研究聚焦于如何改善继发脑损伤。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是一种细胞器,具有独特的拓扑学上的膜网络系统,为蛋白质修饰、折叠和组装提供场所。各种干扰ER功能的损伤刺激均可导致内质网应激(ER stress)。炎症,氧化应激,线粒体钙超载和谷氨酸过度释放可以极大地激活ER应激反应。最后,过载的蛋白质可以进一步触发未折叠的蛋白质反应(unfolded protein response,UPR)。UPR主要通过三种类型的ER应激感受蛋白介导:需要肌醇的酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE 1),RNA激活的蛋白激酶样ER激酶(protein kinase-like ER kinase,PERK)和激活转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)进行。在这三者中,据报道ATF6在UPR中显示出关键作用,且ATF6可激活下游靶点C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)。CHOP 是一种转录因子并且参与 ER 应激介导的细胞凋亡。有学者报道了 ATF6的抑制在脑缺血模型中提供神经保护作用,但是在脑出血中尚未探索ATF6的作用。褪黑素(melatonin)是一种主要由松果体(pineal gland)分泌的胺类激素(amine hormones),具有调节睡眠-觉醒周期的作用。近年来的研究表明,除了睡眠调节,褪黑素还具有抗氧化、免疫调节、抑制炎症、抗凋亡等作用。缺血性卒中的相关研究中也证实了褪黑素能够减轻神经元凋亡,发挥脑保护作用。综上所述,我们推测通过褪黑素抑制ATF6/CHOP介导的ER应激反应能够减轻脑出血后的继发脑损伤,从而发挥脑保护作用。本研究使用大鼠自体血注射模型,建立实验性脑出血模型,使用行为学评估结合分子生物学等多种手段对褪黑素保护机制进行探究,并揭示保护效应背后的分子机理。方法学第一部分SD大鼠在股动脉插管后取自体血,通过立体定向注射到右侧基底节区,构建实验性脑出血模型。在模型构建后1h腹腔注射melatonin,采用低剂量(100mg/kg)和高剂量(150mg/kg)分别注射,并在脑出血后用行为学评估(24h/72h)和大体评估手段(24h)观察melatonin的保护作用在大体上的反映以及保护作用是否有剂量依赖性。确认melatonin治疗的剂量依赖性及最佳剂量后,使用最佳剂量干预并评估大鼠中长期(lw-3w)的神经功能。第二部分将SD大鼠随机分为7组:Sham(假手术)组,ICH 3h(脑出血后3小时)组,ICH 6h 组,ICH 12h 组,ICH 24h 组,ICH 48 组和 ICH 72h 组,分别用 WB测定脑出血后对应时间点ATF6和CHOP的变化。假手术组的处理完全同ICH组,只是最后无自体血注射。根据ATF6和CHOP的表达变化,选择表达量最高或最低的时间点检测免疫荧光,探究ATF6和CHOP与神经元的共表达情况,也为下一步的研究选择研究断面和施加药物干预的最佳时间点。第三部分作为第二部分的继续和深入,本部分重在机制研究。将SD大鼠用随机方式设立为Sham组、ICH+溶剂对照组(ICH+vehicle)、ICH+褪黑素最佳剂量组(ICH+melatonin(150mg/kg))、ICH+干扰 RNA 对照组(ICH+scramble siRNA)、ICH+CHOP 干扰 RNA 组(ICH+siRNA CHOP)、ICH+ATF6 干扰RNA组(ICH+siRNA ATF6),通过干扰RNA(siRNA)技术选择性沉默CHOP或ATF6的表达,反向验证他们在分子机制中的角色以及发挥的作用。运用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)在基因转录层面定量研究ATF6/CHOP及下游蛋白的表达。运用WB技术在蛋白质表达层面定量研究ATF6/CHOP及下游蛋白的表达;通过凋亡最终执行者Cleaved caspase-3(活化的caspase-3)免疫荧光染色和TUNEL染色,在细胞层面验证melatonin的抗凋亡作用以及CHOP被选择性沉默后的效应。结果第一部分神经行为学评分显示,ICH发生后神经功能严重损害,经melatonin治疗的两组均表现出短期(24h/72h)和中长期(lw-3w)神经功能改善,即神经功能损害评分和转角试验评分显著改善,步错试验和转棒试验结果显著改善,且高剂量组的改善更为显著。伊万斯蓝(Evans blue,EB)渗出实验和脑水含量(brain water content)测定的结·果与此一致,ICH造模后伊万斯蓝显著渗出,右侧大脑半球(处理侧)脑水含量显著上升,提示血脑屏障破坏,脑水肿明显;melatonin治疗组大鼠的EB渗出显著减少,脑水含量显著下降,并且高剂量组减少更显著,提示melatonin可以有效保护血脑屏障,减轻脑出血后同侧脑水肿。同时,这种保护效应是剂量依赖的,高剂量(150mg/kg)的保护效果更明显。第二部分WB结果显示,ATF6和CHOP在脑组织中的表达在脑出血后3h就有显著上升,在6h、12h、24h逐步升高,在24h到达峰值,之后在第48h出现下降。因此.选取第24h作为时间点,分别对比ATF6在Sham组和ICH 24h组与神经元标记物(NeuN)的共表达情况。免疫荧光结果显示,ATF6在脑组织中广泛表达,在神经元中丰富表达,且ICH损伤后24h的表达强度升高,与WB的结果一致。第三部分MMP-9同ATF6、CHOP蛋白表达在脑出血后24h明显上升,分别提示血脑屏障破坏和ER应激反应。经过melatonin治疗后,上述3者的表达被抑制,提示melatonin有改善血脑屏障破坏,抑制ER应激的作用。使用CHOP siRNA预处理的大鼠对比Scramble siRNA大鼠,CHOP表达量明显下降,证明对CHOP的RNA抑制有效,ER应激被抑制;同时,ATF的表达未见明显变化,提示ATF在分子通路上不是位于CHOP下游。值得注意的是,CHOP siRNA的预处理还使MMP-9表达下调,提示CHOP的活化是血脑屏障破坏的促进因素。凋亡指标Bcl-2/Bax比值在melatonin治疗后升高,Cleaved caspase-3活化被抑制,显示了melatonin具有抗凋亡作用。CHOP siRNA预处理组对比Scramble siRNA组,表现出类似变化,即Bcl-2/Bax比值上调,Cleaved caspase-3活化被抑制。这些结果表明,CHOP的激活不仅促进ER应激、促进血脑屏障破坏,还能增加凋亡。进一步地,使用ATF6 siRNA预处理后,ATF6和CHOP的表达同步地被下调,且表现出类似的升高Bcl-2/Bax比值,下调Cleaved caspase-3的作用,证明了抑制ATF6也可以有效抑制ER应激和细胞凋亡,且ATF6为CHOP的上游。RT-PCR显示出一致的结果,melatonin干预或ATF6 siRNA预处理能在mRNA水平降低ATF6、CHOP和caspase-3的基因表达;CHOP siRNA预处理能显著降低CHOP和 caspase-3 的转录 RNA,但不影响 ATF6。Cleaved caspase-3 和 TUNEL 荧光染色的结果进一步验证了 melatonin治疗或CHOP siRNA能够显著降低caspase-3的活化,有效减轻脑组织细胞凋亡。结论1.在ICH发生后,大鼠的神经功能明显损害,血脑屏障破坏,同侧脑组织发生脑水肿,melatonin干预能在大体层面显著改善上述情况,且这种改善有剂量依赖性。2.ATF6和CHOP的表达量在ICH发生后3h就明显上调,随后逐步升高,在24h表达量达到峰值。ATF6丰富表达于脑组织各型细胞,且与神经元大量共表达。3.ICH发生后24h,ATF和CHOP表达明显上调,ER应激明显强化,MMP-9表达明显上调,提示血脑屏障破坏严重。选择性沉默CHOP或AFT6基因表达能减缓ER应激,降低细胞凋亡、保护血脑屏障,提示ATF6/CHOP的激活是引发脑出血后ER应激、细胞凋亡和血脑屏障破坏的一个重要的机制。使用melatonin能抑制该通路激活,改善ER应激,有效抑制脑组织内细胞凋亡。使用melatonin治疗能显著降低MMP-9表达,显示血脑屏障保护效应。褪黑素在继发脑损伤中的保护作用很有可能是通过抑制ATF6/CHOP的激活实现的。