糖尿病是一组常见的慢性代谢内分泌疾病,按其病因临床上可分为1型糖尿病和2型糖尿病,其中2型糖尿病约占90%。随着糖尿病发病的年轻化及患病率的不断上升,其已成为21世纪全球面临的最严重、最危急的健康问题之一。糖尿病患病人数逐年递增,并产生影响终生的并发症,致残致死率高,已成为我国乃至全球最沉重的疾病负担。目前糖尿病并无有效的治愈手段,如何对其预防和控制已成为全球关注的重大公共卫生问题,应对2型糖尿病的挑战应当关口前移、防治结合。糖尿病的发生发展主要由遗传因素和环境因素共同决定,糖尿病70%–90%的危险度可归因于不良的环境暴露,膳食作为其中的重要因素,合理的膳食干预成为遏制糖尿病的最有效手段之一。膳食因素中除了有益的营养元素,也存在诸多致病因素。在食品的生产加工过程中,热加工是最常见的方式,其为食物带来独特的风味和诱人的色泽,亦可延长食品的储存期限。然而热加工的美拉德反应也产生诸多有害物质,晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products,AGEs)就是其中一种。AGEs在日常膳食中广泛存在,其暴露无法避免。目前研究认为,长期暴露于高AGEs饮食将促进炎症,影响心血管系统和内分泌系统,从而导致肥胖、糖尿病,并加快糖尿病并发症的发生发展。由于目前AGEs膳食数据库仍不完善,且缺乏精确的定量手段,限制了大规模流行病学的开展。国际糖尿病联盟(IDF)以及美国糖尿病协会(ADA)目前还没有关于AGEs的膳食建议,探讨AGEs与2型糖尿病进展的大样本人群研究证据仍然缺乏。随着色谱和质谱技术的发展,利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)对生物样本的AGEs水平进行评估受到广泛推崇,使得基于生物标志物的大样本人群研究成为可能。AGEs在人体内的代谢和信号转导受多种受体影响,其中最关键的是晚期糖基化终末产物受体(RAGE),其可能介导了AGEs大部分的不良健康效应。编码RAGE的基因AGER的单核苷酸多态性与RAGE的功能和多种代谢性疾病存在关联。AGEs-RAGE信号轴是目前研究的热点。近年来,精准医疗受到各界的广泛关注,探讨个体在不同遗传背景下的暴露因素和疾病结局的关系符合精准医疗的理念。鉴于膳食暴露是机体AGEs的重要来源,其在体内的累积通过RAGE信号轴引起一系列级联反应,从而促进糖尿病等诸多慢性病的发生发展。本研究拟建立一套稳定可靠的UPLC-MS/MS检测手段,同时检测生物样本中多种来源的AGEs;基于病例-对照研究,进一步探讨多种AGEs生物标志物与2型糖尿病的关系;探讨AGEs可溶性受体(s RAGE)作为重要的临床生物标志物,其在糖尿病发生发展中的作用,并深入阐述AGER基因多态性对标志物和疾病结局的交互作用。本研究的主要内容涵盖以下三个部分:第一部分人血浆中晚期糖基化终末产物定量检测方法的建立目的:通过建立一套预处理简便、高灵敏度、高通量的超高效液相色谱串联质谱法(ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS),对人血浆中不同来源的AGEs进行定量检测。方法:应用Agilent 1200SL超高效液相色谱系统串联Agilent 6460三重串联四级杆质谱仪对血浆五种游离型AGEs进行靶向定量检测分析,离子源为电离子喷雾(ESI with Agilent Jet Stream)。扫描模式采用多反应监测(MRM)模式。我们对样本前处理、色谱条件和质谱参数分别进行了优化以期达到最佳灵敏度和分离效果,并参照欧洲药品管理局的生物分析方法验证指南对本分析方法进行验证。结果:样本前处理采用乙腈-甲醇(1:3)进行蛋白沉淀。经质谱和液相参数优化后,分析物(CML、CEL、CMC、MG-H1、Pyr)和相应内标在正模式下进行多反应监测,优化后的分析物定量离子对分别为205.1→84.1(CML)、219.1→84(CEL)、180.0→89.0(CMC)、229.1→70.1(MG-H1)、255.1→148.1(Pyr)。色谱分离采用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(型号:2.1mm×100mm,1.8μm),以乙腈–5m M九氟戊酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。进样量设定为10μL,单样本分析时间为14分钟。方法学验证结果显示,各目标物质分离效果好,出峰时间无明显内源性干扰存在。校正曲线具有良好的线性,四个不同浓度的质控样本的日内和日间精密度均在15%以内,精确度均在±15%范围内,不同浓度水平的平均提取回收率均在85%–115%之间。稳定性试验表明,三个浓度水平的质控样本分别在室温放置24小时、反复冻融3次和低温(–80°C)放置1年时间三种条件下各类AGEs物质均有较好的稳定性。结论:本研究建立了人血浆游离型AGEs的UPLC-MS/MS定量检测方法,该方法前处理简便,灵敏度高,具有较好的稳定性和可靠性,为本课题后续基于生物标志物的流行病学研究奠定了基础。第二部分血浆晚期糖基化终末产物与2型糖尿病及糖调节受损的关联性研究目的:基于已建立的UPLC-MS/MS方法,对血浆样本的多种游离型AGEs定量检测,进行血浆AGEs暴露与糖尿病的关联性研究。方法:基于病例-对照研究设计,根据世界卫生组织1999年糖尿病诊断标准,共纳入836例新诊断2型糖尿病(T2DM)、515例糖调节受损(IGR)以及1214例正常对照组。研究对象的社会人口学资料、生活习惯以及疾病史通过标准化问卷获取,人体测量指标以及生化指标由专业人员进行检测。血浆游离型AGEs通过已建立的UPLC-MS/MS方法进行定量分析。通过多因素逻辑回归探讨多种AGEs以及AGEs评分与T2DM及IGR的关联。结果:各血浆游离型AGEs(CML、CEL、CMC、MG-H1)在NGT、IGR及T2DM中的水平均呈现递增趋势,Pyr在NGT、IGR和T2DM三组间并无显著差异。调整潜在的混杂因素后,血浆各AGEs每增加一个标准差(SD),T2DM的OR(95%CI)分别为:CML,1.40(1.26–1.56)、CEL,1.54(1.38–1.73)、CMC,1.81(1.60–2.06)、MG-H1,1.14(1.02–1.27)。各AGEs与IGR的关联也得到类似的结果,调整混杂因素后,各AGEs每增加一个SD,其OR(95%CI)分别为:CML,1.21(1.08–1.36)、CEL,1.09(0.97–1.22)、CMC,1.40(1.25–1.57)、MG-H1,1.05(0.94–1.18),其效应值与AGEs-T2DM的效应值相比有所减弱。AGEs评分每增加一分,T2DM的OR(95%CI)为2.70(2.20–3.32),IGR的OR(95%CI)为1.52(1.22–1.88)。结论:本研究表明多种AGEs以及整体AGEs负荷水平与T2DM和IGR存在正相关,并呈现剂量效应。第三部分血浆晚期糖基化终末产物受体及其基因多态性与2型糖尿病的关联性研究目的:探讨血浆可溶性晚期糖基化终末产物受体(s RAGE)与2型糖尿病(T2DM)及糖调节受损(IGR)的关联;探索编码晚期糖基化终末产物特异性受体的基因AGER的基因多态性在s RAGE与糖尿病中的作用。方法:该部分基于病例-对照研究设计,根据世界卫生组织1999年糖尿病诊断标准,共纳入1360例新诊断2型糖尿病(T2DM)、859例糖调节受损(IGR)以及2495例正常对照组。所有受试者来源于2012年至2015年期间在湖北省武汉市华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌门诊进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的人群。研究对象基本信息通过标准化问卷获取,人体测量指标以及生化指标由专业人员进行检测。血浆s RAGE通过ELISA试剂盒检测,通过现有文献和1000 Genomes数据库筛选基因位点,基因分型采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(Agena Mass Array system)进行。结果:血浆s RAGE水平在T2DM组、IGR组和正常对照组中分别为879.2(643.0–1214.9),908.3(678.6–1198.3),1075.7(772.3–1436.8)pg/m L。T2DM组和IGR组血浆s RAGE水平显著低于对照组(P<0.001)。限制性三次样条回归模型中,血浆s RAGE浓度与T2DM及IGR风险呈现负相关,趋近于线性剂量-效应关系。Logistic回归结果显示,在调整社会人口学、生活方式、糖尿病家族史及疾病史等混杂因素后,血浆s RAGE水平每增加一个标准差(SD),人群患T2DM和IGR的ORs值分别为0.70(95%CI:0.64–0.76),0.79(95%CI:0.73–0.87)。在各亚组分析中,血浆s RAGE水平与T2DM患病风险的负关联关系依然稳定存在,且在不吸烟的人群中s RAGE的保护作用更强(P for interaction=0.04)。AGER基因第三外显子的错义突变rs2070600的TT携带者与CC携带者比,T2DM的OR为0.65(95%CI:0.43–0.97)。与CC携带者且具有最低s RAGE水平的人群相比,TT携带者且具有最高s RAGE水平的人群患T2DM的风险最低(P for interaction=0.02)。结论:本研究表明血浆s RAGE水平与T2DM和IGR的患病风险呈现负相关,这种关联与AGER rs2070600存在交互作用。