血糖异常升高是肾移植术后常见的并发症。一方面术后血糖升高建议及早使用胰岛素进行控制,另一方面术后使用基础胰岛素能够降低术后新发糖尿病的发病率,所以不论是从预防的角度还是从治疗的角度都建议术后使用胰岛素。肾移植患者对免疫抑制剂的敏感性与其临床疗效密切相关,但是东京药科大学平野教授课题组发现,使用外源性胰岛素会降低肾移植术后患者对免疫抑制剂的敏感性,但是其具体机制尚不清楚。我们推测胰岛素可能通过提高免疫细胞的免疫功能,增强免疫反应,导致机体对免疫抑制剂的敏感性降低,从而增加了免疫抑制剂的使用剂量。为此,我们构建了以下实验体系进行验证：首先,我们观察了生理浓度(5μunits/mL)和超生理浓度(50μunits/mL)胰岛素暴露情况下对泼尼松、氢化可的松、环孢素、他克莫司以及霉酚酸这5种常用免疫抑制剂抗PBMC增殖效应的影响。结果显示,生理浓度和超生理浓度胰岛素的暴露均能显著降低泼尼松、氢化可的松、环孢素、他克莫司以及霉酚酸这5种免疫抑制剂的抗PBMC增殖效应(P<0.05-0.01),提示胰岛素可能具有拮抗免疫抑制剂的作用或者能够提高细胞的免疫功能。假设胰岛素提高了细胞的免疫功能,那么胰岛素是直接作用于免疫细胞,激活免疫反应；还是存在其他的激活免疫反应的机制?如何直接作用于细胞免疫,其作用的发挥应该与细胞表面胰岛素受体的表达密切相关,为此,我们观察了PBMC (human peripheral-blood mononuclear cells,人外周血单个核细胞,主要包括淋巴细胞,还有少量单核细胞)表面胰岛素受体的表达情况；同时我们还观察了用胰岛素受体拮抗剂S961 (insulin receptor antagonist)干预后,胰岛素降低环孢素抗PBMC增殖效应的变化。结果显示,ConA (concanavalin A,伴刀豆蛋白A,是一种T淋巴细胞刺激素)激活的T淋巴细胞表面没有胰岛素受体的表达,而单核细胞表面有一定数量的胰岛素受体表达；使用胰岛素受体拮抗剂S961进行干预,可以逆转胰岛素降低环孢素抗PBMC的增殖效应；综合这两个方面的研究提示胰岛素降低免疫抑制剂的抗PBMC增殖效应可能是通过单核细胞表面的胰岛素受体而发挥作用的。器官移植后出现的排斥反应包括超急性排斥反应、急性排斥反应和慢性排斥反应三个阶段,免疫细胞与内皮细胞的相互黏附贯穿整个过程,抑制免疫细胞与内皮细胞的黏附是拮抗排斥反应的中心环节。那么胰岛素是否具有促进免疫细胞与内皮细胞黏附的作用?课题组观察了胰岛素诱导PBMC与HUVEC (human umbilical vein endothelial cells,人脐静脉内皮细胞)的黏附过程。结果显示,胰岛素在终浓度为50μunits/mL和100μunits/mL时,能有效诱导荧光探针标记的PBMC与HUVEC的黏附(P<0.05),且呈现剂量依赖关系；同时,细胞上清液中,sICAM-1 (可溶性细胞间粘附因子1)和E-selectin(E-选择素)两个重要的黏附趋化因子的表达上调(P<0.05),提示胰岛素可能通过增加PBMC与HUVEC之间的黏附,进而增强免疫反应。丹参酮ⅡA作为活血化瘀中药丹参的有效成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节血糖等作用,其机制多与有效改善内皮细胞的功能有关。但是,对于丹参酮ⅡA增强机体免疫功能的研究却鲜有报道。本次研究中,我们在观察胰岛素效应的同时选择了丹参酮ⅡA作为主要的研究对象,观察了中药有效成分对PBMC与HUVEC之间黏附的影响。结果显示,丹参酮ⅡA在终浓度为1μM和10μM时,可以显著促进两种细胞间的黏附(P<0.05,P<0.01),同时,细胞上清液中,sICAM-1和E-selectin两个重要的黏附趋化因子的表达上调(P<0.05)；提示丹参酮ⅡA在免疫增强效应方面与胰岛素类似。器官移植后应用胰岛素,在防治并发症的同时,却降低了免疫抑制剂的敏感性,这可能与胰岛素提高免疫细胞的功能、增强免疫反应有关；对于临床上器官移植后使用免疫抑制剂同时又使用胰岛素的治疗具有一定的参考意义。移植术后使用免疫抑制剂在抑制排斥反应的同时,也抑制了机体免疫功能,容易造成二次感染等,存在诸多潜在的临床瓶颈。本项研究表明,生理浓度和超生理浓度的胰岛素暴露会降低泼尼松、氢化可的松、环孢素、他克莫司以及霉酚酸这5种常用免疫抑制剂的抗PBMC增值效应；胰岛素降低环孢素的抗PBMC增殖效应可能是通过PBMC中单核细胞表面胰岛素受体来发挥作用的；丹参酮ⅡA具有类似胰岛素的免疫调节作用,可能与增加sIC AM-1和E-selectin的含量,促进PBMC与HUVEC的黏附有关,从而促进PBMC的再循环,增强机体的免疫功能。但是胰岛素在器官移植术后应用的利与弊以及丹参酮ⅡA在器官移植中的临床应用价值还有待于进一步评价。本课题研究包括以下三个部分：研究一胰岛素对泼尼松等5种常用免疫抑制剂抗PBMC增殖效应的影响目的：观察胰岛素对泼尼松、氢化可的松、环孢素、他克莫司以及霉酚酸等5种常用免疫抑制剂抗PBMC增殖效应的影响。方法：我们采用MTT法(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,噻唑蓝)检测泼尼松、氢化可的松、环孢素、他克莫司以及霉酚酸在胰岛素非暴露和暴露情况下PBMC的半数致死量(IC50值)以及其生长曲线。结果：1.生理浓度(5μunits/mL)以及超生理浓度(50μunits/mL)的胰岛素对PBMC没有细胞毒性；2.泼尼松、他克莫司以及霉酚酸在生理浓度胰岛素以及超生理浓度胰岛素暴露下对ConA刺激的PBMC的IC50值要明显高于不加胰岛素组(p<0.05-0.001)；3.氢化可的松以及环孢素在超生理浓度胰岛素暴露下对ConA刺激的PBMC的IC50值要明显高于不加胰岛素组(p<0.05)；但在生理浓度胰岛素暴露下的ConA刺激的PBMC的IC50值与不加胰岛素组相比无显著差异。结论：生理浓度和超生理浓度胰岛素的暴露会降低泼尼松、氢化可的松、环孢素、他克莫司以及霉酚酸等5种常用免疫抑制剂的抗PBMC增殖效应。研究二胰岛素降低免疫抑制剂抗PBMC增殖效应的机制研究目的：观察PBMC表面胰岛素受体的表达情况以及S961 (insulin receptor antagnosit,胰岛素受体拮抗剂)对胰岛素降低环孢素抗PBMC增殖效应的影响。方法：以PE结合的抗鼠IgGlk抗体(anti-IgG1k)作为对照,采用PE结合的鼠抗人-CD220 (anti-insulin receptor)抗体通过流式细胞仪检测PBMC细胞表面胰岛素受体的表达情况。用MTT法观察胰岛素受体拮抗剂S961对胰岛素降低环孢素抗PBMC增殖效应的影响。结果：1.在PBMC中,ConA激活的CD4+和CD14+单核细胞表面有胰岛素受体表达,激活的CD4+T和CD8+T淋巴细胞表面没有发现胰岛素受体的表达；2.胰岛素受体拮抗剂S961在0.1nM、1nM、10nM、100nM的浓度下对PBMC没有细胞毒性；3.胰岛素受体拮抗剂S961可以逆转胰岛素降低环孢素的抗PBMC增殖效应。结论：胰岛素降低环孢素的抗PBMC增殖效应可能是通过PBMC中单核细胞表面的胰岛素受体发挥作用的。研究三胰岛素及丹参酮HA对PBMC与HUVEC黏附的影响目的：观察胰岛素及丹参酮ⅡA对PBMC与]HUVEC黏附的影响方法：使用荧光探针分别标记PBMC和HUVEC,用胰岛素及丹参酮ⅡA分别干预HUVEC后,激光共聚焦显微镜下观察PBMC与HUVEC的黏附数量；同时用ELISA试剂盒检测sICAM-1和E-selectin这两种黏附分子的含量。结果：1.随着胰岛素剂量的增加,PBMC黏附于]1UVEC的数量呈上升趋势,在胰岛素终浓度为50μunits/mL(p<0.05)和100μunits/mL(p<0.05)时,与对照组相比具有统计学差异；胰岛素可以增加sICAM-1和E-selectin的含量,在胰岛素终浓度为50μunits/mL(p<0.05)和100μunits/mL(p<0.05)时,sIC AM-1和E-selectin的含量与对照组相比具有统计学差异；2.随着丹参酮ⅡA剂量的增加,PBMC黏附于HUVEC的数量呈上升的趋势,在丹参酮ⅡA终浓度为1μM(p<0.05)和10gM(p<0.01)时,PBMC黏附于HUVEC的数量与对照组相比具有统计学差异；丹参酮ⅡA可以增加sICAM-1和E-selectin的含量,在丹参酮ⅡA终浓度为101μM(p<0.05)时,sICAM-1和E-selectin的含量与对照组相比具有统计学差异。结论：胰岛素可以通过促进PBMC与HUVEC的黏附而增加PBMC(主要是淋巴细胞)的再循环,从而增强机体的免疫功能,可能与sICAM-1和E-selectin的含量增加有关。丹参酮ⅡA具有类似胰岛素的免疫调节作用,它能促进PBMC与HUVEC的黏附,从而增强机体的免疫功能,可能与sICAM-1和E-selectin的含量增加有关。