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脓毒症是由机体感染引起的全身炎症性反应综合征(systemic inflammation response syndrome,SIRS)。过度的炎症反应被认为在脓毒症的发生发展中起着至关重要的作用。TNF-α是一种重要的炎性因子,它以两种形式存在:跨膜TNF-α(tmTNF-α)和分泌型TNF-α(sTNF-α)。越来越多的证据表明sTNF-α在内毒素休克中发挥重要作用,tmTNF-α在内毒素休克中可能与sTNF-α发挥不同的作用。tmTNF-α既可以作为配体通过正向信号介导靶细胞的生物学效应,也可作为受体通过反向信号介导tmTNF-α表达细胞的生物学功能。本研究旨在探讨tmTNF-α正向信号对内毒素休克的影响及其分子机制,为tmTNF-α抗体在临床休克中的应用提供理论依据。主要结果如下:一、tmTNF-α Ab对不同LPS致死率的保护作用1.tmTNF-α抗体对100%LPS致死剂量的保护作用:100%LPS致死剂量时,tmTNF-α抗体可以明显提高C57BL/6小鼠LPS所致内毒素休克的生存率(45%),延迟死亡时间,商品化TNF-α中和抗体Infliximab无明显作用。2.tmTNF-α抗体对50%LPS致死剂量的保护作用:50%LPS致死剂量时,商品化TNF-α中和抗体Infliximab可以提高LPS所致内毒素休克的生存率达66.6%,tmTNF-α抗体也可以明显提高C57BL/6小鼠LPS所致内毒素休克的生存率达80%。二、tmTNF-α正向信号诱导RAW264.7巨噬细胞抵抗LPS1.构建稳定转染NIH3T3-vector和NIH3T3-wtTNF-α稳转细胞株用小鼠wtTNF-α的逆转录病毒感染NIH3T3细胞,流式结果显示:NIH3T3-wtTNF-α细胞膜表面tmTNF-α表达率高达70%以上,该细胞膜表面tmTNF-α作为外源性tmTNF-α的来源,用以研究其正向信号。2.tmTNF-α正向信号对LPS诱导炎症因子产生的影响2.1.tmTNF-α正向信号抑制LPS诱导Raw264.7产生IL-1β和IL-6:用4%多聚甲醛固定的NIH3T3-wtTNF-α和NIH3T3-vector细胞分别与Raw264.7以10:1 比例预先培养 30 min 后加入 100 ng/ml LPS 刺激,Real-time PCR 和 ELISA结果显示tmTNF-α正向信号可抑制LPS诱导的RAW264.7细胞IL-1β和IL-6的基因转录,同时减少IL-1 β和IL-6分泌。2.2.tmTNF-α正向信号抑制LPS诱导Raw264.7产生NO:用4%多聚甲醛固定的NIH3T3-wtTNF-α和NIH3T3-vector细胞分别与Raw264.7以10:1比例预先培养30 min后加入100 ng/ml LPS刺激,结果显示外源性tmTNF-α可以明显抑制LPS诱导的iNOS的基因转录及NO的产生。2.3.tmTNF-α正向信号对LPS诱导Raw264.7产生抑炎细胞因子IL-10无影响:用4%多聚甲醛固定的NIH3T3-wtTNF-α和NIH3T3-vector细胞分别与Raw264.7以10:1比例预先培养30 min后加入100 ng/ml LPS刺激,结果显示外源性tmTNF-α对LPS诱导的IL-10的基因转录及蛋白分泌均无影响。3.tmTNF-α正向信号对LPS/TLR4信号通路的影响3.1.tmTNF-α正向信号抑制LPS活化NF-κB:LPS刺激Raw264.7细胞30 min后导致IκB-α显著减少。预先给予外源性tmTNF-α可以显著的抑制LPS诱导的IκB-α降解。3.2.tmTNF-α正向信号抑制LPS活化MAPK:LPS刺激Raw264.7细胞30 min后导致ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化,预先给予外源性tmTNF-α可以显著降低LPS诱导上述MAPK的磷酸化水平。三、TNFR2介导tmTNF-α的抑炎作用1.缺失TNFR2可完全阻断tmTNF-α正向信号抑制LPS诱导BMDM炎性因子基因转录:用LPS分别刺激来自野生型、TNFR1KO和TNFR2KO小鼠的BMDM 4 h,Real-time PCR结果显示,预先30 min给予外源性tmTNF-α可抑制LPS诱导野生型和TNFR1KO BMDM细胞的IL-1β、IL-6和iNOS的基因转录;但是,对于LPS诱导TNFR2KO BMDM细胞的IL-1β、IL-6和iNOS的基因转录则无影响,提示缺失TNFR2可解除tmTNF-α的抑制作用。2.缺失TNFR2可完全阻断tmTNF-α正向信号抑制LPS诱导BMDM炎性因子分泌:用LPS分别刺激来自野生型、TNFR1KO和TNFR2KO小鼠的BMDM 10 h,结果显示,预先30 min给予外源性tmTNF-α可抑制LPS诱导野生型和TNFR1KO BMDM细胞的IL-1β、IL-6和NO的分泌;但是,对于LPS诱导TNFR2KO BMDM细胞的IL-1β、IL-6和NO的产生则无影响,提示缺失TNFR2可完全封闭tmTNF-α的抑制作用。3.缺失TNFR2可完全阻断tmTNF-α正向信号抑制LPS诱导BMDM的NF-κB和MAPK的活化:用LPS分别刺激来自野生型、TNFR1KO和TNFR2KO小鼠的BMDM 30 min,结果显示,预先30 min给予外源性tmTNF-α可抑制LPS诱导野生型和TNFR1KO BMDM细胞的IκB-α降解和ERK1/2、JNK1/2和p38的磷酸化,但是,对LPS诱导TNFR2KO BMDM细胞的NF-κB和MAPK的活化则无影响,提示缺失TNFR2可完全消除tmTNF-α的抑制作用。四、tmTNF-α正向信号对LPS/TLR4通路负性调控分子的影响1.tmTNF-α正向信号对LPS/TLR4通路负性调控分子mRNA水平的影响:LPS刺激Raw264.7细胞4 h后可诱导A20和MCPIP1 mRNA的转录,却明显降低Triad3A mRNA的水平;预先给予外源性tmTNF-α可显著促进LPS诱导的A20和MCPIP1基因转录,解除LPS对Triad3A的抑制作用,并使之基因转录增强。2.tmTNF-α正向信号对MCPIP1蛋白水平的影响:Western blot显示LPS刺激3 h后MCPIP1表达明显升高,给予外源性tmTNF-α干预后MCPIP1的表达进一步升高。3.siRNA阻断MCPIP1的表达可以完全解除tmTNF-α正向信号的抑制炎症作用:Realtime PCR结果显示用siRNA沉默MCPIP1可完全阻断外源性tmTNF-α对LPS诱导Raw264.7细胞IL-1β、IL-6和iNOS mRNA转录的抑制作用。五、TNFR2基因敲除对tmTNF-α抗体抵抗LPS诱导内毒素休克的影响上述结果证实外源性tmTNF-α通过TNFR2发挥抑炎作用,而tmTNF-α抗体可促进tmTNF-α表达,TNFR2基因敲除是否会影响该抗体对内毒素休克的保护作用?1.tmTNF-α抗体对WT和TNFR2基因敲除小鼠LPS诱导内毒素休克生存率的影响:腹腔注射LPS(30mg/kg),提前30 min给予30mg/kg tmTNF-α抗体腹腔注射,连续观察72 h。令人吃惊的是:这个剂量的LPS导致90%BALB/c小鼠死亡,tmTNF-α抗体可提高生存率达20%;TNFR2KO小鼠LPS的存活率为23%,tmTNF-α抗体则提高生存率达77%。2.tmTNF-α抗体对WT和TNFR2基因敲除小鼠LPS诱导内毒素休克细胞因子的影响:进一步检测细胞因子,结果显示tmTNF-α抗体可提高2种基因型小鼠LPS模型中腹腔巨噬细胞表面tmTNF-α的表达,明显降低血清sTNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子的水平。结论:tmTNF-α通过TNFR2介导的正向信号作用于巨噬细胞,抑制NF-κB和MAPK的活化,诱导巨噬细胞对LPS的抵抗;tmTNF-α可通过上调MCPIP1等负性调控分子抑制LPS诱导的炎症反应,进而在内毒素休克中发挥保护作用。