比率荧光探针所具有的多种优点使其在80年代以来得到了迅速发展，它采用的比率法测量技术克服了以往单波长探针的一些缺陷，如单波长探测量的数据是单一波长处的荧光强度，而荧光强度易受外部环境（如温度）、样品本身（如浓度）、仪器条件（如光散射、光漂白、背景光）等因素的影响，需要严格控制实验条件才能得到较准确的结果。所以在本文中我们设计的主要是比率荧光探针，并将其应用效果做了初步检测。本文分别介绍了设计比率荧光探针时常用的的几种机理，荧光共振能量转移（FRET）、分子内电荷转移（ICT）、光诱导电子转移（PET）、激基缔合物（Monomer-Excimer）的形成或消失、激发态分子内质子转移（ESIPT）等，本文中探针依据的检测原理主要是ICT机理，荧光团部分采用香豆素类化合物。首先设计了用来检测OCl~-的比率荧光探针1b。目前已报道的OCl~-探针主要是单波长探针和我们实验室之前设计的一个比率型探针，但该探针的pH应用范围为9.0，不适用于生物体内应用。新设计的探针1b的pH应用范围是在6.0~9.0，适合物生物体内应用，且在这个范围内其选择性和竞争性效果很好；通过对响应后的产物结构的表征，我们证明了探针是被还原成了醛；细胞比率成像的效果也很明显，达到我们的预期目的。其次设计的CN~-探针是一个结构简单、容易制备但检测效果很好的比率型探针，它和以往的探针相比，最大优点在于检测限低、动力学范围宽、响应迅速，且检测过程不受体内其它阴离子等的影响；通过密度泛函理论（DFT）得到探针的最优结构，并计算出最可能的反应位点；根据质谱、氢谱对反应过程的实时监测，推测响应机理并表征了响应产物的结构。最后设计的半胱氨酸探针Ratio-Cys是第一个可以将半胱氨酸和高半胱氨酸、谷胱甘肽鉴别开来的比率型荧光探针。光谱实验主要研究了反应的动力学过程，得到的二级动力学常数表明Ratio-Cys和半胱氨酸的反应比高半胱氨酸、谷胱甘肽要快得多且能够反应完全，这也可能是探针能够选择性检测半胱氨酸的根本原因；另外又通过质谱对反应过程的监测证明了该反应过程可能是先根据Baldwin规则生成一个七元成环中间体，再与另一分子的半胱氨酸发生加成反应，这同时也解释了为什么探针对高半胱氨酸、谷胱甘肽的响应迟缓且反应不完全；探针与半胱氨酸反应后荧光波长显著移动，可以用于细胞中半胱氨酸的比率成像。