论文部分内容阅读
非生物环境胁迫,如低温、高盐等,会严重危害植物生长发育,降低作物的产量和品质。近年来,与此胁迫相关的大量MYB基因被克隆及功能鉴定,但在苹果上相应的研究还很少。我国是苹果生产和育种大国,苹果砧木与品种的遗传改良以及抗逆新品种的培育显得尤为重要。在苹果遗传转化方面,虽有遗传转化体系应用的大量报道,但转化效率普遍较低。高再生频率是高遗传转化的前提,而苹果离体再生频率高低很大程度上依赖于试材基因型。本试验在前人对153份苹果种质资源再生能力比较研究的基础上,对已筛选出的高再生材料新疆野苹果31进行系统研究,建立了离体再生及遗传转化体系,为后续苹果转基因研究及基因功能鉴定提供参考。本研究探讨了影响新疆野苹果31离体再生及遗传转化的条件,结果表明,当叶片正面接触培养基、暗培养14天时,再生频率达到最高;6-BA 1.0 mg·L-1与NAA0.1 mg·L-1为继代增殖培养基的最佳激素配比;组培苗在附加1.0 mg·L-1IBA的1/2 MS培养基上生根效果较佳。外植体在OD600=0.5菌液中浸染5 min,共培养2 d,在附加300 mg/L Cef的再生培养基上延迟培养2-4 d后,在附加300 mg·L-1 Cef和1.5 mg·L-1 Hyg的再生培养基上进行筛选培养,GUS瞬时染色效率达到最高。在此条件下对遗传转化体系进行验证,抗性芽获得率可高达5%左右,从而建立了离体再生及遗传转化体系。根据基因登陆序列号在苹果’金冠’基因组中的信息,克隆了苹果MdMYB4/44基因。MdMYB4基因编码区全长为495 bp,可编码164个氨基酸,MdMYB44基因开放式编码阅读框为729 bp,编码242个氨基酸。系统进化树分析表明,MdMYB4与拟南芥AtMYB4、苹果MdMYB16、MdMYB17的亲缘关系最近,而MdMYB44与拟南芥AtMYB44亲缘关系最近。MdMYB4/44蛋白均定位于细胞核,具有一定的酵母激活活性。qRT-PCR分析表明,MdMYB4/44在待测所有组织部位均有表达,其中MdMYB4在茎段中的表达量最高,在叶片中的表达量最低,而MdMYB44基因在叶片中的表达量最高,在果实中表达量最低。此外,MdMYB4基因的转录水平会因NaCl、PEG、4℃诱导而上调表达,该基因过表达增强了转基因苹果愈伤对NaCl、4℃的抗性,表明,MdMYB4在NaCl、4℃胁迫反应中担任正调控因子;MdMYB44基因会受NaCl、PEG、4℃诱导而下调表达,该基因过表达降低了转基因苹果愈伤对NaCl、4℃的抗性,表明该基因作为负调控因子以响应低温、高盐胁迫反应。利用HPLC法对转基因与野生型苹果愈伤WT中苹果酸含量进行检测。结果表明,MdMYB4转基因愈伤中苹果酸含量与WT无显著差异,而MdMYB44转基因愈伤苹果酸含量得以显著提高,表明MdMYB44基因过表达促进了苹果酸积累。利用qRT-PCR对苹果酸代谢相关基因的表达进行分析,结果表明,与WT相比,MdMYB44转基因愈伤M-PPi的表达水平显著提高,而M-ME、MVA-A、CyMDH、PEPC基因表达水平无显著差异。表明MdMYB44基因过表达可能主要通过M-PPi基因表达水平的提高,促进苹果酸转运及在液泡中的积累。