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类固醇激素,又称甾体激素,是具有环戊烷多氢菲结构的脂溶性激素的总称。类固醇激素检测是临床实验室重要的内分泌项目。氢化可的松,也称皮质醇,是临床重要的肾皮质腺功能的指标;睾酮是最重要的雄性激素之一。实验室测定血清类固醇激素的常规方法为化学发光、电化学发光法和放射免疫分析法等免疫学方法以及近年来发展迅速的临床质谱方法。然而国内外室间质量评价计划(EQA)的数据显示,血清氢化可的松和睾酮不同方法的结果之间仍存在一定差异,在低浓度水平及特殊人群(如孕妇、服用外源性治疗药物患者)的样本上表现更为突出。保证临床检验结果的准确性和可比性,实现血清氢化可的松和睾酮检测的标准化,亟需建立成熟可靠的参考方法。血清中氢化可的松和睾酮少量以游离的形式存在,绝大多数以与蛋白结合的形式存在,浓度水平低、基质复杂、结构类似物众多,建立高度准确的参考方法面临诸多挑战。根据国际临床检医学溯源联合委员会(JCTLM)的参考方法列表,目前国际上仅有少数研究机构建立了血清氢化可的松和睾酮的参考测量程序,均以同位素稀释质谱法为测量原理,采用液液萃取、柱层析或固相萃取、衍生、二重色谱等或其组合作为样本前处理的方法,使用气相色谱质谱(GC-MS)或液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测。这些参考测量程序已成功应用于血清氢化可的松和睾酮标准化工作中。但它们也存在操作比较复杂、技术要求较高或分析时间过长等问题。本研究启动前,我国尚未系统地建立相应的参考方法。在第一部分“同位素稀释液相色谱串联质谱法测定血清氢化可的松候选参考方法的建立”中,本研究以硫酸葡聚糖-氯化镁为脂蛋白沉淀剂,除去血清基质中大量存在的脂类干扰物质,对样本进行预净化,再使用优化的液液萃取的方法使氢化可的松与血清分离。对质谱和液相色谱条件进行全面考察,得到最优组合,在12min完成整个LC-MS/MS分析。方法评价的结果显示,所建立的候选参考方法在76.30 nmol/L～768.04 nmol/L浓度范围内的批内和总变异系数分别为0.3%～0.6%和0.7%～1.2%。测定包含34份单人份患者血清的有证标准物质ERM-DA451,进行线性回归分析,得到回归方程为Y=1.0092 X-0.7455(斜率95%置信区间0.9940～1.0212,截距95%置信区间-3.6575～2.6390,相关系数为0.999)。方法的最低检测限(绝对值)为5 pg,不受内源性和外源性氢化可的松结构类似物的干扰,具有高度的特异性和灵敏度,满足临床使用的需要。参加IFCC RELA国际参考实验室比对,所得结果与其他参加实验室达到等效一致。在第二部分“同位素稀释液相色谱串联质谱法测定血清睾酮候选参考方法的建立”中,本研究使用液液萃取、羟丙基-β-环糊精水溶液提取净化的方法进行血清睾酮的前处理。对同位素内标的平衡时间,内标的添加方法、色谱质谱条件等环节进行优化和考察,建立了候选参考测量程序。血清睾酮测定的批内、批间和总变异系数(CV)的均值(范围)为0.84%(0.22%～2.00%)、1.01%(0.48%～2.37%)和1.37%(0.53%～3.09%)。分析有证参考物质ERM DA-345a和NIST SRM 971,测定结果与认定值的平均偏倚范围为-2.0%～+1.8%。方法的最低检测限(绝对值)为8 pg,未见明显的睾酮结构类似物的干扰,具有高度的特异性和灵敏度,满足临床使用的需要。参加IFCC RELA国际参考实验室比对,所得结果与其他参加实验室达到等效一致。在第三部分“血清氢化可的松和睾酮候选参考方法的应用研究”中,本研究以所建立的血清氢化可的松和睾酮候选参考方法为基础,设计和组织了第一次全国类固醇激素正确度验证调查计划。该计划以混合人血清为基质,制备了具有良好互换性的调查样本,经评价,调查样本的均匀性检验合格,可在-70℃下稳定保存至少28个月。将样本通过干冰运输发放至50家使用免疫学等检测方法和50家运行临床质谱方法的实验室,实验室按程序重复测定后上报结果,以参考方法测定的靶值评价参加实验室血清氢化可的松和睾酮检测结果的正确度。调查结果显示,血清氢化可的松两个批号调查样本各仪器组稳健均值与参考方法靶值的偏倚为-12.4%～+17.8%,组内变异系数为3.7%～21.3%;血清睾酮两个批号调查样本各仪器组偏倚为-33.4%～+5.5%,组内变异系数为3.8%～11.4%。我国血清氢化可的松和睾酮实验室检测的质量仍有待提高。综上所述,本研究以同位素稀释液相色谱串联质谱法为基本原理,分别以脂蛋白沉淀-液液萃取和液液萃取-环糊精净化为样品前处理方法,建立了血清氢化可的松和睾酮的候选参考测量程序。方法操作简便,结果精密可靠,可望推荐作为参考方法。以建立的候选参考方法为基础,本研究组织了第一次全国类固醇激素正确度验证调查计划,初步评价了我国实验室血清氢化可的松和睾酮免疫学方法和临床质谱法的检测现状。上述工作的完成,为我国血清氢化可的松和睾酮检测标准化的实现提供了必要的工作基础和保障。