论文部分内容阅读
生物体内有多条应激应答信号通路,在机体适应环境方面起着至关重要的作用。其中,丝裂酶原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路作为其中重要的调节细胞反应的信号通路在真核细胞中广泛存在。凋亡信号调节激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1),是MAPK家族的重要成员之一,位于P38和JNK(c-JUN N-terminal kinase)的上游并经磷酸化反应激活它们。多种应激损伤及促炎因子(H202,TNF-α,缺血再灌注及化疗药物等)均可激活ASK1,而活化的ASK1又依次激活MKK3/MKK6-P38及MKK-4/MKK7-JNK激酶途径,对应激做出应答或促使细胞凋亡。体外研究结果表明,活化的ASK1可启动多种生物学反应过程,包括不同种类细胞的凋亡,炎症,分化及生存。野生型ASK1的过度表达或组成上活性突变产物可诱导各类细胞的凋亡。有研究进一步发现,小鼠ASK1基因的破坏可明显降低肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平及氧化应激诱导的各种细胞凋亡水平,这表明ASK1是各种应激诱导细胞凋亡的关键因素。目前已知,ASK1的激活在神经、心血管、肿瘤等多种疾病中均起着重要作用。肾脏疾病中的研究表明,大鼠梗阻性肾病模型中肾小管上皮细胞的ASK1/P38信号通路激活,在肾脏炎症,凋亡及纤维化发生的过程中起重要作用。ASK1在缺血再灌注导致的急性肾损伤模型中同样被激活,阻断ASK1能减少肾小管上皮细胞的凋亡,减少单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的表达水平并改善肾功能。在糖尿病肾病模型中,已有的研究报道阻断ASK1的激活及P38的磷酸化,可以减轻肾小球硬化,减少肾小球损伤。FOGO教授的前期研究发现,在5/6肾切除大鼠的慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)模型中,倍量使用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotension converting enzyme inhibitors,ACEI)依那普利可明显改善肾功能,但长期随访中并未发现依那普利可以明显延缓或逆转肾脏病的进展。因此研究多途径治疗方法来延缓CKD进展显得十分必要。因此我们提出ASK1抑制剂(Apoptosis signal-regulating kinase 1 inhibitor,ASK-1I)与依那普利(ACEI)联合使用,观察单独用药与联合治疗对CKD大鼠的肾保护作用,并探讨其可能的作用机制。第一部分ASK1抑制剂和依那普利联合干预对5/6肾切除大鼠的肾保护作用目的:研究ASK1抑制剂和依那普利联合干预对5/6肾切除大鼠的肾保护作用。方法:48只5/6肾切除大鼠饲养8周后平均分四组:(1)对照组(CONT)(2)ASK1抑制剂组(GS-444217,ASK-1I)(3)依那普利组(Enalapril,ENA)(4)ASK1抑制剂+依那普利组(ASK-1I+ENA)。0周、8周、12周分别检测各组大鼠安静状态下尾动脉收缩压、尿微量白蛋白/肌酐比值(albumin creatinine ratio,ACR)、血肌酐、肌酐清除率(creatinine clearance rate,Ccr)。8周、12周大鼠肾组织制作病理片测定肾小球硬化指数(sclerosis index,SI)。结果:1.所有大鼠8周后均出现高血压,蛋白尿,肾小球硬化和血肌酐升高,血Ccr下降;治疗4周后对照组和ASK1抑制剂组的血压下降变化幅度不大,依那普利组及ASK1抑制剂+依那普利联合治疗组血压有明显下降(P<0.05);2.与对照组比较,12周时联合干预组尿ACR明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。干预4周后依那普利组和联合干预组大鼠尿ACR变化水平较对照组明显下降,有统计学意义(P<0.05);3.干预4周后ASK1抑制剂组和联合干预组的大鼠肌酐清除率变化呈正性增长,提示肾功能改善,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而对照组和依那普利组的肌酐清除率变化呈负性增长,提示肾功能进一步恶化;4.单独干预治疗组减轻了肾小球硬化指数变化,联合干预组部分逆转了肾小球硬化的进展。12周时联合干预组与对照组相比,肾小球硬化指数显著减少,肾小球硬化指数变化率呈负性增长,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:ASK1抑制剂联合依那普利作用于5/6肾切除大鼠,可以明显降低血压和蛋白尿,改善肾功能,部分逆转肾小球硬化,与单用依那普利或ASK1抑制剂相比,有更好的肾保护作用。第二部分ASK1抑制剂和依那普利联合干预对5/6肾切除大鼠肾保护的机制研究第一篇ASK1抑制剂和依那普利联合干预对5/6肾切除大鼠氧化应激反应的影响目的:研究ASK1抑制剂和依那普利联合干预对CKD大鼠的肾保护作用,探讨其对氧化应激途径调控的可能机制。方法:免疫组化法检测各组WT1、ED1水平。Western-blot测定各组肾组织中磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)的蛋白表达水平,ELISA法测定尿DNA/RNA氧化损伤指标。结果:1.与对照组相比,依那普利和ASK1抑制剂单独干预组均不能改善WT1染色阳性细胞密度,而联合干预组可以明显提高WT1染色阳性细胞密度,差异有统计学意义(P<0.05)。2.12周时依那普利组能明显降低肾小球内的ED1阳性面积,抑制巨噬细胞在肾小球内浸润,而ASK1抑制剂组肾小球内的ED1阳性面积升高,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3.与对照组比,联合干预组有抑制尿DNA/RNA氧化损伤标志物的趋势,但差异无统计学结果。4.与对照组相比,依那普利及ASK1抑制剂单独干预均没有降低GAPDH的蛋白质表达水平,依那普利组GAPDH的蛋白质表达水平反而升高,而联合干预组明显降低了GAPDH的蛋白子表达水平(P<0.05)。结论:ASK1抑制剂和依那普利联合干预可抑制氧化应激反应,保护足细胞,降低巨噬细胞浸润的炎症反应,起到更好的肾脏保护作用。第二篇ASK1抑制剂和依那普利联合干预对5/6肾切除大鼠MAPK通路调控的影响目的:为进一步研究ASK1在MAPK通路中的作用,我们检测ASK1下游信号P38、JNK的磷酸化水平,同时检测大鼠肾脏的凋亡细胞水平,进而推断其相关机制。方法:TUNEL法比较各组凋亡细胞水平,Western-blot测定各组P38、JNK。结果:1.ASK1抑制剂单独干预组和联合干预组与对照组比较均可明显降低P38、JNK的磷酸化水平,尤其是P38磷酸化水平,抑制非常完全,有明显统计学意义(P<0.05)。2.各干预组对肾小球凋亡细胞均无减少,联合干预组及ASK1抑制剂组较依那普利组及对照组明显减少肾小管间质凋亡细胞水平,有明显统计学意义(P<0.05)。结论:ASK1抑制剂和依那普利联合作用于5/6肾切除大鼠,通过抑制MAPK通路下游的P38、JNK磷酸化,减少细胞凋亡,起到更好的肾保护作用。第三篇ASK1抑制剂和依那普利联合干预对5/6肾切除大鼠TGF-β/Smad3信号通路表达的影响目的:研究ASK1抑制剂和依那普利联合干预对5/6肾切除大鼠肾脏纤维化的影响方法:Western-blot法测定各组肾组织中TGF-β/Smad3信号通路、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子(Type I plasminogen activator inhibitor,PAI-1)的蛋白质水平的表达。结果:1.与对照组相比,依那普利组和ASK1抑制剂单独干预组和联合干预组肾组织中PAI-1的蛋白表达水平有下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。2.与对照组相比,ASK1抑制剂单独干预组和两者联合干预组肾组织中Smad3的蛋白表达水平有下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。3.与对照组相比,依那普利和ASK1抑制剂单独干预组肾组织中CTGF的表达水平无统计学意义,而联合干预组肾组织中CTGF表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)结论:联合干预组是通过抑制TGF-β/smad3通路,减轻促纤维化因子CTGF的表达,降低细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解酶抑制物PAI-1表达,起到更好的延缓肾纤维化的作用。结论1、ASK1抑制剂联合依那普利作用于5/6切除肾小鼠,可以降低蛋白尿、降低血压,改善肾功能,甚至部分逆转肾小球硬化。2、ASK1抑制剂和依那普利单用或联合使用可抑制MAPK下游的P38、JNK磷酸化,减轻细胞凋亡,抑制氧化应激反应,减少巨噬细胞浸润及足细胞损伤,抑制TGF-β/smad3通路,降低肾脏纤维化标志物的表达,进而逆转肾小球硬化,比依那普利或ASK1抑制剂单独使用具有更好的肾保护作用。