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组织工程技术有望成为牙槽嵴裂临床治疗的有效策略。构建具有高效成骨诱导活性的生物支架是骨再生的关键。纳米纤维复合羟基磷灰石可以模拟骨基质中胶原纤维和钙磷无机成分，是骨组织工程理想的支架材料。模拟体液浸泡是纤维表面复合磷灰石涂层的常用方法。该方法简单，反应条件温和，形成磷灰石化学成分与骨磷灰石相似。然而经典模拟体液(SBF)仿生矿化过程较慢，高倍模拟体液（如5SBF）可加快仿生矿化进程，但溶液不稳定，易在仿生矿化早期析出均质钙盐，影响材料表面磷灰石成核和生长。因此构建高效稳定模拟体液矿化体系是生物支架仿生矿化过程中亟待解决的问题。本课题通过设置仿生矿化环境CO2分压，模拟人体内环境重碳酸盐缓冲体系，研究高倍模拟体液稳定性及支架表面矿化涂层的形成。 本研究利用Hepamine聚合体修饰仿生矿化纤维支架，并进一步负载成骨多肽，构建提供取向形貌、钙磷成分和成骨多肽的三元复合仿生支架，模拟细胞外基质理化性能。通过细胞ALP活性、成骨相关基因表达和细胞外钙盐沉积检测探讨三元复合仿生支架对材料表面PMSC成骨分化效能的影响，为牙槽嵴裂骨组织工程技术提供理论依据。 第一部分 稳定5SBF矿化体系构建和仿生矿化取向纳米纤维支架的制备 目的： 研究模拟体液仿生矿化过程中CO2分压对溶液稳定性和纤维表面矿化涂层形成的影响;初步探讨仿生矿化纤维支架取向形貌和钙磷成分在PMSC成骨分化过程中的相互作用。 方法： 以聚己内酯(PCL)为原料，通过静电纺丝技术和平行动态收集装置制备取向纳米纤维支架，通过扫描电镜(SEM)观察纳米纤维形貌特征。利用细胞培养箱和摇床设置CO2分压和溶液震荡速度，测量不同CO2分压、溶液振荡速度和支架浸泡时间下5SBF pH值变化和支架重量改变。通过扫描电镜(SEM)、能量色散X射线光谱仪(EDX)、傅立叶红外光谱分析仪(FTIR)和X射线衍射(XRD)观察分析纤维支架表面矿化涂层形貌特征、化学元素和成分组成。通过细胞增殖实验和碱性磷酸酶(ALP)活性检测研究仿生矿化取向纳米纤维支架表面腭粘膜间充质干细胞(PMSC)的增殖和成骨分化。 结果： 1.PCL纳米纤维表面光滑，平均直径0.86±0.20μm。纤维取向性好，可引导PMSC细胞骨架极性分布。纤维密度随纺丝收集时间呈线性增加。 2.仿生矿化过程中改良5SBF保持清亮，溶液pH值稳定，支架重量随浸泡时间增加而增加。 3.改良5SBF中纤维表面可形成非均质矿化涂层，涂层为晶化程度较低的碳酸根取代羟基磷灰石，微观形貌为纳米尺寸片层状结构，Ca/P较高。 4.仿生矿化PCL纤维支架和PMSC共培养时，HA/PCL-150组细胞数目和ALP活性高于HA/PCL-200组(P＜0.05)。 结论： 通过设置CO2分压构建的改良5SBF性质稳定，短时间可在纤维表面形成非均质矿化涂层，矿化物在结构和成分组成与骨磷灰石更加相似，并可通过溶液振荡速度和支架浸泡时间进一步调控磷灰石沉积速度。仿生矿化取向纳米纤维支架模拟细胞外基质中胶原纤维和钙磷成分，具有良好的生物相容性和骨引导能力，是骨再生研究中较为理想的生物支架。 第二部分 成骨多肽BFP-1的制备及其对PMSC增殖和成骨分化的影响 目的： 体外研究BFP-1对PMSC增殖和成骨分化的影响，并探讨BFP-1适宜浓度。 方法： 使用Rink树脂和Fmoc保护氨基酸单体固相合成多肽BFP-1，通过高效液相色谱仪分析、提纯和验证多肽BFP-1。采用AlamarBlue方法研究PMSC的增殖。采用细胞ALP活性和细胞外钙盐沉积检测研究PMSC的成骨分化。 结果： 1.成功制备多肽BFP-1，主产品呈亲水性，提纯后多肽纯度约为96％。 2.BFP-1各实验组PMSC均能正常生长和增殖，生长培养期间各实验组细胞数目均不高于对照组。 3.成骨诱导培养时，BFP-1各实验组细胞ALP活性和对照组之间无明显差异（P＞0.05）。成骨诱导培养第21天，BFP-1各实验组细胞外钙盐沉积明显增加，F-0.5，F-1和F-10三组细胞外钙盐沉积明显高于对照组，其中F-1组细胞外钙盐检测值最高（P＜0.05）。 结论： 成骨多肽BFP-1具有良好的细胞相容性，成骨诱导条件下BFP-1可以明显促进PMSC成骨分化后期细胞外钙盐的沉积。二维培养时BFP-1对PMSC的增殖无明显促进作用。结合ALP和细胞外钙盐沉积检测结果，BFP-1在骨再生或修复过程中极有可能扮演调控因子的角色。 第三部分 成骨多肽BFP-1，B2-1和腺苷酸在PMSC成骨分化过程中的相互作用 目的： 研究成骨多肽B2-1对PMSC增殖和成骨分化的影响;比较BFP-1，B2-1和腺苷酸促PMSC成骨分化的潜能;研究成骨多肽BFP-1，B2-1和腺苷酸在PMSC成骨分化过程中的相互作用。 方法： 采用Alamar Blue方法检测PMSC的增殖;通过细胞ALP活性和细胞外钙盐沉积检测PMSC的成骨分化。 结果： 1.B2-1各实验组PMSC均能正常生长和增殖。生长培养第5天和成骨生长培养第7天，B2-1各实验组细胞数目多于对照组(P＜0.05)。 2.成骨诱导培养时，B2-1各实验组与对照组细胞ALP活性无明显差异（P＞0.05）。成骨诱导培养第14天和21天， B-0.5和B-1两组PMSC细胞外钙盐沉积高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。 3.成骨诱导培养第21天，BFP-1和B2-1多肽组细胞外钙盐沉积高于腺苷酸组和对照组(P＜0.05)，BFP-1组高于B2-1组，差异有统计学意义（P＜0.05）。腺苷酸组和对照组无明显差异(P＞0.05)。 4.成骨诱导培养时，BFP-1或B2-1多肽添加腺苷酸后细胞外钙盐沉积减少，第21天F-1+A组细胞外钙盐沉积明显低于F-1组（P＜0.05）。 5.生长培养时BFP-1和B2-1多肽组合实验组细胞数目均不高于对照组。成骨诱导时，BFP-1和B2-1多肽组合实验组和相应单一多肽对照组细胞外钙盐沉积无明显差异（P＞0.05）。 结论： B2-1成骨多肽可以促进PMSC增殖和成骨分化。BMP-7来源的BFP-1和BMP-2来源的B2-1在PMSC成骨分化过程中无协同作用。小分子腺苷酸在成骨诱导条件下未能进一步增加PMSC细胞外钙盐沉积，并且与成骨多肽BFP-1或B2-1之间存在拮抗作用。认识间充质干细胞成骨分化过程中不同信号通路相互作用，将为骨再生相关研究提供重要信息和科学策略。 第四部分 三元复合仿生纳米纤维支架的构建与生物学活性评价 目的： 研究亲和力技术修饰后仿生矿化纳米纤维支架成骨多肽BFP-1的负载能力和释放，构建提供取向形貌、钙磷成分和成骨多肽的三元复合仿生支架，促进支架表面PMSC成骨分化。 方法： 制备仿生矿化PCL纳米纤维支架(HA-PCL)和成骨多肽BFP-1。合成Hepamine聚合体，制备Hep-HA-PCL支架。采用荧光胺方法检测BFP-1在HA-PCL和Hep-HA-PCL两种支架表面的负载和释放。采用Alamar Blue方法、ALP活性、成骨相关基因Runx2和OCN表达以及细胞外钙盐沉积检测BFP-1/HA-PCL和BFP-1/Hep-HA-PCL三元复合仿生支架表面PMSCs的增殖和成骨分化。 结果： 1.Hep-HA-PCL支架肝素负载量为271.3±9.5μg，肝素分布均匀。Hep-HA-PCL微观形貌与HA-PCL支架无明显区别，支架表面静态接触角为0°。 2.Hep-HA-PCL支架表面BFP-1多肽负载量明显高于HA-PCL支架(P＜0.05)。两种支架表面BFP-1均呈持续性释放，其中Hep-HA-PCL支架表面BFP-1释放速率更加恒定。 3.HA-PCL，BFP-1/HA-PCL和口BFP-1/Hep-HA-PCL三组材料表面PMSC均能正常生长和增殖。生长培养第7天， BFP-1/HA-PCL和BFP-1/Hep-HA-PCL组细胞数目多于HA-PCL组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 4.成骨生长培养第3天，BFP-1/Hep-HA-PCL组细胞ALP活性和Runx2基因表达高于BFP-1/HA-PCL和HA-PCL组， 其中BFP-1/Hep-HA-PCL和BFP-1/HA-PCL两组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。成骨生长培养第14天，BFP-1/HA-PCL组细胞OCN表达和细胞外钙盐沉积高于BFP-1/Hep-HA-PCL组和HA-PCL组，差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论： 仿生矿化纳米纤维支架非均质矿化涂层可有效负载和控释BFP-1。Hepamine聚合体修饰可使支架BFP-1负载能力明显增强，支架表面BFP-1的释放更加恒定。BFP-1/HA-PCL和BFP-1/Hep-HA-PCL三元复合仿生纳米纤维支架可以促进PMSC的增殖和早期成骨分化，有望成为骨再生过程中的理想支架。