研究背景及目的:在哺乳动物细胞中,普遍存在着Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)家族,其归属于模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),遗传性状被种属基因所调控,行使着识别病原体相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的功能。相应的PAMPs,例如细菌、病毒及真菌等对免疫细胞的刺激,可促使其表达此类受体分子。与其它TLRs类似,TLR4凭借着特异性识别功能,使其能够结合细菌脂多糖(lipopolysaccharide/endotoxin,LPS)而活化。TLR4是介导针对病原体相关分子的免疫反应的一个非常重要的分子,其活化能够促进固有免疫系统的抗原提呈细胞功能性成熟,并触发促炎介质的释放。TLR4在细胞膜上识别并结合LPS后,沿MyD88(myeloid differentiation primary response gene 88)依赖以及TRAM-TRIF依赖两条途径,开始了各自独立的炎症信号级联传递。此过程中接头蛋白TIRAP和TRAM起着分别募集信号适体蛋白MyD88和TRIF的作用,并与之配对从细胞膜及早期内体分别启动两条分子信号通路,将炎症信号级联传递到胞内,活化核转录因子,引起炎症因子和Ι型干扰素的释放。由于该通路过度激活会引起严重的炎症及脓毒症,因此信号转导过程中还有多种负调节蛋白分子参与信号转导反馈性抑制作用。这些负调控分子与炎症信号通路中的效应分子交互作用,构成精密而又复杂的网络调节体系,最终决定着炎症细胞活化的程度。目前对LPS/TLR4信号转导通路的研究仍在不断进行中,有些调节机制尚待明确,许多调控分子还有待发现。NF-κB作为LPS/TLR4炎症信号转导通路中的最重要的核转录因子,参与了两条信号通路的转导,对通路中炎症介质的转录合成到了起关键调控作用。正常状态下,它与其抑制物IκB形成复合物处于无活性状态。细胞感受到外界刺激信号后,会将胞外这些信号转导至胞浆,使IκB发生磷酸化降解,NF-κB得到活化而进入细胞核,继而相关基因启动转录表达,释放炎症细胞因子TNF-α、IL-6及IFN-γ。因此,寻找针对NF-κB调控的新方式能够使了解LPS/TLR4信号通路的相关作用机制的程度得到进一步深化。泛素(ubiquitin,Ub)可与靶分子共价结合介导蛋白质降解,在转录调节、信号传递、炎症免疫等方面发挥着重要作用。关于小泛素相关修饰物特异性蛋白酶6(sumo-specificprotease6,senp6),据最近研究报道,也会产生类似泛素的功效,令nf-κb必需调节蛋白(nf-κbessentialmodifier,nemo)去sumo(smallubiquitinrelatedmodifier)化,使nf-κb活性受到抑制,进而展现其负调控nf-κb相关信号通路的功能。由于senp6是一个新发现的nf-κb的抑制分子,目前对其在巨噬细胞中的表达调控机制尚不明确。小分子rna是一段长度约20-24核苷酸的非编码小分子rna,能够在目标分子的mrnas上,锁定其3’端非翻译区(3’-untranslatedregion,3’-utr)进行结合,从而介导目标mrna的降解或是遏制目标分子在翻译水平的表达。多项研究表明,作为近年来的研究热点之一的小分子rna(micrornas,mirnas)是蛋白质在翻译后水平的重要调控元件,有着非常广泛的作用范围。目前的研究表明,有多种与感染、炎症免疫相关的蛋白均受到mirnas的调控。另外,mirnas在调节tlrs信号转导方面也发挥着重要作用。而mirnas是否能够通过调节使senp6高表达从而调控nf-κb转录活性,这仍需要后续的研究来确认。除转录因子nf-κb外,其上游的受体分子tlr4也在myd88/tram-trif两条信号通路的转导中都起到了重要作用。活化的tlr4能够分别启动并调控两条通路的信号转导,因此对两条信号转导通路而言,它均具有重要生物学意义。而且有研究表明,在lps介导的细胞活化中,细胞活化程度的强弱及相应的信号转导很大程度上受质膜上tlr4的数量及其在胞内转运效率的影响;抑制tlr4-lps复合物的内化会促进myd88信号通路的活化。因此,tlr4将tram-trif信号途径跟myd88信号途径紧密联系在了一起,tlr4在胞膜及细胞器的分布变化可能对两条通路信号的产生发挥了平衡调控作用。在真核细胞中,细胞内的转运活动由关键调控分子rab蛋白(rasrelatedinbrain)调节。rab蛋白不仅对tlr4的转运过程起到了调控作用,而且其转运效率对tlr4的分布可能产生了重要影响。简而言之,有很大可能,胞内转运蛋白rab介入了对lps/tlr4活化单核、巨噬细胞效应的调控过程,但是还有待进一步的实验来揭示在此过程中rab蛋白具体是如何发挥作用的。之前,本课题组发现,氯喹(chloroquine,cq)能够使脓毒症小鼠的生存率发生显著提高;氯喹预处理人外周血单个核细胞(hpbmc)以及小鼠巨噬细胞(ana-1)会对lps的活化(tnf-α、il-6等多种细胞因子释放)产生显著的负调控效果。而cq本身不能结合和直接拮抗lps的活性,因此其对炎症的抑制效应只能作用于lps/tlr4信号通路的效应分子。研究显示,作为一种得到广泛应用的抗炎药物,氯喹能够对lps/tlr4介导的单核、巨噬细胞过度活化产生抑制效果,但是迄今仍未明确该作用的潜在分子机制。这些提示我们,由于转录因子nf-κb能够控制炎症细胞因子的释放,cq很可能对的细胞因子上游的重要转录因子nf-κb产生抑制作用,这使我们考虑是否senp6也可能与cq对lps/tlr4信号通路的抑制作用有关。另外,课题组在之前的实验中还发现,cq可能对细胞膜表面的tlr4表达有影响。这提示tlr4可能受到cq的药效影响,导致其在胞内的转运效率发生变化。该过程很可能与胞内转运分子rab对tlr4分布的调节有关,从而促使tlr4在质膜上的数量及细胞内的分布发生变化,造成tlr4聚集至胞内细胞器或内体而不再参与信号转导,进而使lps诱导的单核巨噬细胞活化受到抑制。鉴于cq对lps/tlr4信号通路中多个效应分子的调节作用,我们应用此功能将其作为工具对lps/tlr4信号转导通路进行深入研究。本课题从cq对lps/tlr4的两条信号转导通路的抑制功能研究切入,藉由对不同炎症效应分子作用的实验,从两个方面阐述lps/tlr4信号通路的负调控作用可能的发生机制。一方面研究senp6/mirnas直接对炎症信号通路中最重要的转录因子nf-κb产生的调控作用及相应机制;另一方面则探讨胞内转运关键分子rab通过调节细胞中tlr4分布表达,而对tlr4介导的两条下游信号通路活化的影响及其可能机制。综上所述,本课题以cq的炎症抑制作用作为切入点,藉由对lps/tlr4信号通路被抑制的效应进行生物学机制研究,为进一步阐明lps/tlr4介导的巨噬细胞活化中一些关键环节的调节机制并发掘新的炎症调控分子奠定实验基础。方法:1.氯喹抑制lps/tlr4信号转导通路的功能研究1.1用浓度20μg/mlcq对小鼠巨噬细胞raw264.7预处理1h后,加入lps(100ng/ml)刺激24h,细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β蛋白表达情况以elisa法确定;1.2westernblot(wb)检测tlr4下游炎症信号通路分子变化:nf-κb上游抑制物iκb-α、干扰素调节因子3(irf3)及信号通路mapks中的jnk、erk1/2、p38蛋白及其磷酸化水平;1.3激光共聚焦定位检测转录因子nf-κb的亚基p65及irf3转位入核情况。2.mir-669n调控senp6在抑制lps/tlr4信号通路中作用的机制研究2.1检测senp6和cq之间是否存在量效关系及其对lps刺激的巨噬细胞活化的作用:(1)用不同剂量cq(0、5、10、20μg/ml)对小鼠巨噬细胞raw264.7预处理1h后,加入lps(100ng/ml)刺激24h,然后senp6mrna及蛋白水平分别以实时荧光定量pcr(rt-pcr)及westernblot(wb)法确定;(2)以构建的senp6过表达及shrna干扰载体(pcdna3.1)对raw264.7细胞进行24h的转染,通过以实时荧光定量pcr和westernblot确定的senp6基因及蛋白水平变化对转染效果进行评估;(3)senp6过表达及干扰载体转染raw264.7细胞,然后lps处理24h,以elisa法进行细胞因子tnf-α、il-6、ifn-γ蛋白变化的检测。2.2生物信息学预测并确定raw264.7细胞中以senp6为靶标分子的mirnas(1)通过靶标分析软件targetscan、miranda、mirecords预测,选择与靶基因senp6的3’utr序列互补的mir-669n;(2)用不同剂量cq(0、5、10、20μg/ml)对小鼠巨噬细胞raw264.7预处理1h后,加入lps(100ng/ml)刺激24h后收样,经rt-pcr检测确定mir-669n在mrna水平上出现的变化;(3)构建mir-669n过表达及反义表达载体(antisenseofmir-669n,as-mir-669n)转染raw264.7细胞,mir-669n的mrna水平通过实时荧光定量pcr确定,以对转染效果进行评估;(4)构建目标靶点萤光素酶报告载体,与mir-669n过表达及反义抑制表达载体共转染raw264.7细胞,根据荧光表达情况判断mir-669n是否能影响靶基因的表达。2.3确认mir-669n通过senp6调控lps刺激的巨噬细胞活化(1)将raw264.7细胞以mir-669n过表达以及反义表达载体分别进行转染处理至24h,实时荧光定量pcr和westernblot检测mir-669n对senp6基因及蛋白水平的影响;(2)mir-669n过表达及反义表达载体分别转染raw264.7细胞24h,后lps(200ng/ml)处理24h,以elisa法进行细胞因子tnf-α、il-6及ifn-γ改变情况的测定;(3)通过尾静脉注射mir-669n及as-mir-669n载体,建立mir-669n过表达及表达抑制的脓毒症小鼠模型:将c57bl/6雌性小鼠(10周龄)分为对照组、mir-669n过表达组和抑制表达组,每组10只。分别尾静脉注射生理盐水配制的载体,48h后腹腔注射lps(20mg/kg),3h后收集外周血elisa法检测细胞因子,分离肝脏枯否细胞提取mrna及蛋白,实时荧光定量pcr和westernblot检测mir-669n、senp6基因及蛋白水平以评价转染效果;观察、记录小鼠状态至40h,以确定mir-669n的表达变化对脓毒症小鼠的影响。3.rab5/7调节tlr4分布在抑制lps/tlr4信号通路中作用的机制研究3.1氯喹调节tlr4的表达及分布的功能研究(1)以wb确定细胞tlr4总蛋白被cq调节而产生的改变;(2)以流式细胞术对cq调节胞膜上tlr4表达的改变进行检测;(3)激光共聚焦定位检测tlr4细胞内定位情况:免疫荧光分别标记tlr4(cy3)、早期内体(eea1,fitc)、晚期内体/溶酶体(lamp1,fitc)、高尔基体(giantin,fitc)、rab11(循环内体,fitc)在lps及cq处理前后观察tlr4在细胞内的定位分布情况。3.2rab5/7调控lps/tlr4信号通路的机制研究3.2.1表达改变的rab5、7造成的lps/tlr4信号通路变化(1)结合rab的已知功能筛选出对tlr4分布产生明显影响的rab5和rab7,通过rt-pcr和wb法分别检测其mrna及蛋白水平变化,以确定cq是否对早期内体转运分子(rab5)以及晚期内体转运分子(rab7)产生调节作用。(2)采用sirna技术分别干扰rab5、7表达,将其转染raw264.7细胞24h后,rab5、7基因及蛋白水平分别通过实时荧光定量pcr及westernblot法确定,以对干扰效果进行评估;(3)以sirna对raw264.7细胞进行转染,之后cq预处理1h细胞,再以lps(100ng/ml)刺激24h,以elisa法进行细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β的变化测定;(4)sirna分别干扰rab5、7后,按照前面实验方法药物处理细胞,westernblot检测tlr4下游炎症信号通路分子变化:iκb-α、irf3、mapks信号转导通路中jnk、erk1/2、p38及其蛋白磷酸化水平;(5)sirna分别干扰rab5、7后,激光共聚焦定位检测转录因子nf-κb的亚基p65及irf3转位入核情况;(6)构建目标靶点nf-κb及irf3的反应性基因(ifn-β)的萤光素酶报告载体,分别与sirnarab5、7共转染raw264.7细胞24h,cq预处理细胞1h,再加入lps(100ng/ml)刺激6h,双萤光素酶实验检测能够反映nf-κb及irf3活性的变化水平。3.2.2nh4cl预处理引起的lps/tlr4活化巨噬细胞作用的变化:(1)用浓度500μg/mlnh4cl对小鼠巨噬细胞raw264.7预处理1h后,加入lps(100ng/ml)刺激24h,细胞因子tnf-α、il-6及ifn-β的变化以elisa法测定;(2)westernblot检测nh4cl预处理对rab5、7分子的蛋白表达水平的影响。4.统计学分析:全部计量资料以均值±标准差(mean±sd)形式体现。统计数据采用单因素比较(one-wayanova),以p<0.05为有显著性差异。选择spss13.0进行数据统计学处理。结果:1.氯喹抑制lps/tlr4信号转导通路的功能研究1.1elisa结果显示,cq能够显著下调炎症细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β的表达(p<0.05);1.2westernblot结果表明,cq能够显著下调tlr4下游多个炎症信号通路分子的磷酸化水平(piκb-α、p-irf3、p-jnk、p-erk1/2、p-p38),显著促进表达iκb-α(p<0.05);1.3激光共聚焦结果显示,cq能够明显抑制核转录因子nf-κb亚基p65及irf3的转位入核。2.mir-669n调控senp6在抑制lps/tlr4信号通路中作用的机制研究2.1检测senp6的表达是否与cq相关及其对lps介导的巨噬细胞活化的影响(1)senp6的蛋白表达与cq具有正向量效关系,而其基因表达与cq无相关性;(2)通过rt-pcr及wb检测senp6的表达,发现构建的senp6过表达及shrna干扰载体转染效果明显;(3)senp6过表达后,炎症细胞因子明显下调(p<0.05),反之亦然。2.2生物信息学预测并确定raw264.7细胞中以senp6为靶标分子的mirnas(1)通过生物信息学预测结合文献得到以senp6为靶基因的mir-669n;(2)mir-669n分子的表达与cq具有负向量效关系;(3)构建的mir-669n过表达及反义表达载体转染细胞后对其表达影响效果明显;(4)通过以senp6为靶点的双荧光素酶报告载体,验证了mir-669n能与senp6的mrna预测位点结合。2.3确认mir-669n通过senp6调控lps刺激的巨噬细胞活化(1)结果显示,mir-669n能显著抑制raw264.7细胞的senp6蛋白水平的表达(p<0.05),但对其基因水平无显著影响;(2)mir-669n过表达使巨噬细胞炎症因子表达显著上调(p<0.05),而其表达抑制则使巨噬细胞炎症因子表达显著减少(p<0.05);(3)在mir-669n过表达及表达抑制的脓毒症小鼠模型中,mir-669n过表达使小鼠外周血细胞因子表达显著上调(p<0.05),而其表达抑制则使外周血细胞炎症因子表达显著减少(p<0.05);小鼠枯否细胞的mir-669n检测结果表明转染效果明显,而且mir-669n能显著抑制senp6蛋白水平的表达(p<0.05),但对其基因水平无显著影响;mir-669n过表达会使脓毒症小鼠生存率显著降低,而其表达抑制使脓毒症小鼠生存率显著提高(p<0.05)。3.rab5/7调节tlr4分布在抑制lps/tlr4信号通路中的作用机制研究3.1氯喹调节tlr4的表达及分布的功能研究(1)westernblot结果表明,经cq对raw264.7细胞进行预处理,并没有显著变化出现在tlr4总蛋白水平上;(2)流式细胞术结果表明,cq预处理后,细胞表面tlr4表达明显减少;(3)激光共聚焦定位结果显示,cq预处理后,tlr4与早期内体(eea1)及晚期内体/溶酶体(lamp1)标志物的共定位明显增强(黄色荧光共定位增强)。3.2rab5/7调控lps/tlr4信号通路的机制研究3.2.1表达改变的rab5、7造成的lps/tlr4信号通路变化(1)rt-pcr以及wb结果显示,早期内体转运分子(rab5)及晚期内体转运分子(rab7)的mrna及蛋白水平受到cq的作用,均分别发生了显著上调(p<0.05);(2)sirna分别沉默rab5、7分子后,rt-pcr及wb检测结果显示对两个分子具有良好干扰效果;(3)sirna分别沉默rab5、7分子后,elisa结果显示,炎症细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β的表达显著上调(p<0.05);(4)sirna分别沉默rab5、7分子后,westernblot结果表明,tlr4下游多个炎症信号通路分子的磷酸化水平(piκb-α、p-irf3、p-jnk、p-erk1/2、p-p38)显著上调,iκb-α的表达显著下调(p<0.05);(5)sirna分别沉默rab5、7分子后,激光共聚焦结果显示,核转录因子nf-κb亚基p65及irf3的转位入核明显增加;(6)rab5、7分子分别被相应sirna沉默之后,通过双萤光素酶实验结果发现,nf-κb及irf3的转录活性显著上调,即nf-κb反应性基因及ifn-β的荧光比值分别发生显著上调(p<0.05)。3.2.2nh4cl处理细胞后,elisa结果显示,炎症细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β表达水平无显著变化;westernblot结果显示,rab5、7分子的蛋白表达水平无显著变化。结论:1.确定cq的预处理对lps/tlr4介导的myd88依赖及trif/tram依赖的两条信号途径均起到了抑制作用。2.senp6蛋白能够负调控巨噬细胞活化;验证了mir-669n的靶标分子是senp6,而mir-669n的表达下调可以促进senp6蛋白水平增加;mir-669n对靶标senp6的负调控作用可能是通过两者mrna的结合而抑制其蛋白翻译的功能。mir-669n表达抑制引起的SENP6蛋白高表达能够显著抑制巨噬细胞的活化,并且对脓毒症小鼠具有保护作用。3.CQ预处理能够促进LPS-TLR4复合体的内化,使TLR4在早期内体及晚期内体中聚集;Rab5、7的表达上调会使其细胞内转运效率提高,可能进而影响到TLR4的胞内分布;Rab5、7两者中任何一个发生表达抑制,均会造成CQ抑制LPS/TLR4介导的细胞活化的作用显著减弱。因此,转运分子Rab5、7可能协同合作以调节TLR4在细胞中分布的方式,从而发挥其炎症抑制效应;CQ的炎症抑制效应与其酸化抑制作用无关,而是与Rab5、7分子的表达水平相关。4.对LPS/TLR4介导的细胞活化的抑制作用可能需要多个调控分子的协同作用,藉由对炎症信号通路的中不同的效应分子的调节,从多方面发挥炎症抑制作用。