第一部分HUVEC钙储池排空后STIM1的转位变化及其在核钙信号中的作用实验背景Store-operatedCa2+(SOC)在细胞生理活动中充当着非常重要的作用,其控制着许多功能,如细胞内钙库的充盈、酶的激活、基因转录、细胞因子的释放等等。但是关于SOC通道的分子结构、蛋白组成以及其调控机制一直都未知,直至近几年大量研究表明STIM1及Orail共同参与SOC通道的开放。STIM1最先是由于其肿瘤抑制作用被人们所关注,其在人免疫缺陷病及多类肿瘤中都有着重要作用,直到2005年Jack Roos小组发现,STIM1在哺乳类动物SOC通道中起到重要的作用。STIM1是一种存在于内质网上的跨膜蛋白,其含有几个保守且重要的结构域：位于内质网腔的EF-hand及sterile a motif(SAM),从蠕虫到蝶类再到人类EF-hand和SAM都是很保守的结构域；位于胞浆中的卷曲螺旋区和脯氨酸、赖氨酸富集区。STIM1N端的EF-hand位于内质网内是一钙离子感受器,可以感受内质网中Ca2+的变化：当钙库内Ca2+充盈时,EF-hand以单聚体的形式存在,该单体有着致密的α螺旋结构；Ca2+排空时,EF-hand的致密螺旋结构减少,促进二聚体和低聚物的形成。其它的结构域,如SAM、卷曲螺旋区和脯氨酸赖氨酸富集区则在STIM1的转位以及胞膜SOCs通道激活起到至关重要的作用。ER通过钙泵ATP酶来实现摄取和储存钙的功能,TG是钙泵ATP酶的抑制剂,作用后钙库不能摄取并储存钙,从而达到钙库排空的目的。当ER钙库充盈时,STIM1位于内质网内的N端EF-Hand与内质网内的Ca2+结合。在TG作用后,ER钙库排空时,STIM1EF-Hand与Ca2+解离,STIM1转位于胞膜,其胞浆C端与Orail1结合暴露出另一SOCs通道不可或缺的CRAC激活域(CRAC activation domain (CAD),也叫SOAR或者OASF), SOCs被激活开放从而导致Ca2+内流,钙库重新充盈,STIM1回到静息结构。这种信号传递分为四步：1)感受到内质网Ca2+浓度降低,STIM1的EF-hand和Ca2+解离；2)与Ca2+解离后,STIM1迅速形成低聚物；3)S1TM1低聚物的C端指引其向胞膜方向移位；4)转位至胞膜附近的STIM1颗粒与Orail1结合激活SOC通道。然而本实验室却发现在HUVEC细胞中STIM1在TG作用后发生了向细胞核膜转位的现象(见胡亚莉论文)。那么这样一种向细胞核膜的转位是否有着其特殊的生理意义呢?比如参与到细胞核钙信号的调控?而关于核钙信号的调控机制一直都是争论不休,一部分人认为细胞核钙信号主要受胞浆钙信号调控,而另一部分人则认为其存在着自己独立的钙信号调控系统。根据以往的研究我们认为细胞核很可能有着自己独立的钙信号系统,那么STIM1是否也参与该调控过程呢?实验目的干扰HUVEC中STIM1表达后观察STIM1在细胞核钙信号系统中的作用。实验方法在HUVEC中转入STIM1干扰质粒后,给予TG作用后,重新给予2mM外钙后观察转染组与未处理的细胞细胞胞浆及核钙信号差别。实验结果1, HUVEC转入STIM1干扰质粒稳定筛选后,细胞STIM1表达水平被抑制了(73.4±2.2)%,p<0.01；而转入空质粒(98.5±3.6)%和非特异性干扰质粒(99.1±5.9)%的细胞STIM1表达水平与正常对照组无统计学差异。2, STIM1干扰组细胞给予TG(R1)后给予2mM细胞外钙(R2)其胞浆R2/R1为0.31±0.03,核R2/R1为0.13±0.006,n=54,；相比较正常对照胞浆R2/R1为1.23±0.06,核R2/R1为1.30±0.10,n=80均有统计学差异,p<0.01,STIM1干扰组的核R2/R1被抑制(89.6±2.5)%,胞浆R2/R1被抑制(76.4±4.3)%两者差异有统计学意义,即核钙信号抑制更明显,p<0.01。而空质粒组胞浆R2/R1为1.36±0.05,核R2/R1为1.28±0.05,n=94。实验结论1, STIM1在HUVECs中蛋白表达被抑制后SOCs通道开放引起的钙内流受到抑制。2, STIM1在HUVECs蛋白表达被抑制后核钙信号受到抑制。本实验提示：STIM1参与HUVECs SOC通道开放,同时参与HUVECs核钙信号调控第二部分HUVEC中STIM1的基因突变后的转位现象,以及其在核钙信号中的作用研究背景本实验室发现HUVECs中STIM1在TG作用后发生向细胞核膜转位的现象,并且其在参与胞浆钙调控的同时参与到细胞核钙信号的调控。而在以往的研究中发现STIM1在TG作用后发生向细胞膜转位并参与细胞膜SOCs通道的开放。那么是什么原因造成这样的差异呢?在以往的实验中SOC或者CRAC通道研究,基因突变,往往作为你一种研究手段还探讨某一结构域的功能。如在人严重联合免疫缺陷综合征(SCID)T细胞的研究中发现,T细胞受体或者钙库排空均不能引起细胞膜SOCs通道开放细胞外钙内流。随着深入研究发现SCID病人的T细胞Oraill发生了点突变。而也有一些研究表明作为ER钙感受器的STIM1,其EF-hand的钙离子结合序列发生突变时,由于不能其EF-hand不能与钙结合,即使细胞内钙库充盈的情况下,STIM1即颗粒样聚集后向细胞膜转位,与Oraill一起激活SOCs通道引发外钙内流。因此我们怀疑是否因为在HUVECs中STIM1发生了突变从而造成其功能改变。后来本实验室从HUVECs中发现了信号肽附近的点突变,于是将突变型STIM1构建成质粒用于对突变型STIM1的进一步研究。另外本实验室曾有实验表明(见阎岩论文)在HUVECs中给予TG排空钙库后,重新加入细胞外钙,加入不同浓度的细胞外钙使细胞胞浆及核内钙信号出现不同程度的升高,递减的细胞外钙伴随着细胞胞浆钙信号的递减,而当给给予低于0.1mM细胞外钙时细胞核钙信号不再下降,因此我们相信在HUVECs中存在着自己独立的钙信号系统,并且我们将0.1mM细胞外钙作为选择性的研究独立核钙信号。实验目的1,探索野生型及突变型STIM1与胞浆及核钙的关系2,观察野生型及突变型STIM1在钙库排空后的转位现象3,研究HUVECs野生型及突变型STIM1在核钙信号中的作用4,研究HEK293中野生型及突变型STIM1在核钙信号中的作用实验方法1,通过Realtime PCR半定量三个供体的野生型及突变型STIM1的表达量,再将其与同供体的胞浆及核钙信号(1μM组胺刺激)做线性回归分析,以探索其两两间的关系。2,通过过表达野生型及突变型STIM1后给予TG排空钙库观察其转位现象。3,通过过表达野生型及突变型STIM1、干扰STIM1来研究其在HUVECs核钙信号中的作用4,通过过表达野生型及突变型STIM1、干扰STIM1来研究其在HEK293核钙信号中的作用实验结果1,实验采用三个供体HUVECs给予1μM组胺刺激后其胞浆及核钙浓度峰值与野生型、突变型STIM1做相关性分析。实验分为：野生型STIM1三个供体及标准曲线；突变型STIM1三个供体及标准曲线；内参及标准曲线。经内参标准化后以其中一供体为1,得到的PCR产物野生型STIM1为1、0.67、1.07；对应的突变型STIM1为1、1.33、2.44。相应供体的钙浓度峰值胞浆分别为：96.386±3.523,107.139±6.661,142.359±6.840；核钙浓度峰值分别为：169±9.12,210±20.081,250.915±34.439。野生型STIM1与胞浆钙相关系数为0.328没有相关性,p>0.05,其与核钙相关系数为0.256没有相关性,p>0.05；突变型STIM1与胞浆钙相关系数为0.202没有相关性,p>0.05,突变型STIM1与胞浆钙相关系数为0.636有相关性,p<0.01。2,实验设为：野生型STIM1;突变型STIM1的时间空白对照(即不给于TG刺激)；突变型STIM1。过表达野生型及突变型STIM1后的细胞给予TG作用引起钙库排空,STIM1发生转位现象,可见野生型STIM1在钙库钙浓度发生变化后发生向细胞膜周转位聚集,突变型的空白时间对照则无明显的转位现象发生,而突变型STIM1则在部分向细胞膜转位聚集的同时又一部分发生向细胞核膜转位聚集。突变型STIM1在细胞内钙库钙浓度发生变化后,细胞内某一STIM1颗粒随着时间的变化由细胞胞浆向细胞核膜转位并沿着细胞膜滑行；突变型STIM1在细胞内钙库钙浓度发生变化后在细胞核膜上不同的时间点有突变型STIM1颗粒转位至此,而时间对照及野生型STIM1则未观察到该现象。同样突变型STIM1的时间荧光曲线在钙库钙浓度发生变化时同一核膜位点的在STIM1转位至此的荧光加强,而时间对照及野生型STIM1的时间荧光曲线则未观察到该现象。3,实验分为正常对照组、过表达野生型STIM1组、过表达突变型STIM1组、STIM1干扰组。正常对照组、转染空质粒,过表达STIM1正常对照组、过表达野生型STIM1组、STIM1干扰组经Western Blotting分析,以正常对照为100%,各组STIM1蛋白表达水平依次为正常对照(100±0.674)%、空质粒(101.975±1.846)%、野生型STIM1(137±2.063)%、突变型STIM1：133.558±1.375)%、STIM1干扰(73.84±0.536)%。给予TG排空钙库后(R1),置换为O.1mM外钙(R2),反应回到基线后置换为2mM外钙(R3),正常对照组胞浆R2/R1为0.131±0.008,R3/R1为1.498±0.049,核R2/R1为0.148±0.008,R3/R1为1.655±0.05(n=21)；过表达野生型STIM1组胞浆R2/R1为0.15±0.01相比正常对照增加了(14.6±7.4)%,p>0.05无统计学差异,R3/R1为2.009±0.05,相比正常对照增加了(34.1±3.5)%,p<0.01有统计学差异,核R2/R1为0.19±0.011相比正常对照增加了(18.4Q7.2)%,p>0.05无统计学差异,R3/R1为1.919±0.068相比正常对照增加了(15.4+4)%,p<0.01有统计学差异,且核R3/R1增加大于胞浆,p<0.01有统计学差异；过表达突变型STIM1组胞浆R2/R1为0.218±0.013,相比正常对照增加了(73.4±10.4)%,R3/R1为2.069±0.087,相比正常对照增加了(39.1±5.8)%,核R2/R1为0.328±0.02相比正常对照增加了(28.5±14)%,R3/R1为2.54±0.07(n=25)相比正常对照增加了(73.8±04.7)%,p<0.01均有统计学差异,且核R2/R1及R3/R1增加均大于胞浆,p<0.01有统计学差异；STIM1干扰组胞浆R2/R1为0.01±0.004,相比正常对照减少了(93.1±3.4)%,R3/R1为0.353±0.016,相比正常对照减少了(76.4±10.7)%,核R2/R1为0.04±0.03相比正常对照减少了(100±0.02)%,R3/R1为0.141±0.01,相比正常对照减少了(91.5±0.6)%,p<0.01均有统计学差异,核与胞浆R2/R1差别无统计学差异,p>0.05,核与胞浆R3/R1有统计学差异,p<0.01。实验结论1,突变型STIM1发生向核膜转位,而野生型STIM1则主要向细胞膜转位2,突变型STIM1发生向核膜转位并参与核钙信号的调控第三部分HUVEC STIM1所调节的核钙信号引起的转录以及其基因表达中的作用实验背景大量研究表明,胞浆与核钙能明显调控基因表达。据报道核钙激活CREB活性在突出活动所必须的神经保护中起到了很重要的作用。在小鼠海马神经元中,蛋白能够直接激活转录因子ATF(转录激活因子3)。在海马神经元由CREB诱导的ATF3表达由NMDA受体引起的钙内流触发,并且该过程核钙浓度的改变及钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ的激活都是必需的。过表达CREB及激活ATF1能导致黑色素瘤的进程和代谢加快,至少能部分促进肿瘤细胞的存活及刺激MMP2(基质金属蛋白酶)的表达。为了探索HUVECs STIM1相关的核钙信号的生物效应我们在给予刺激后检测CREB活性及由核钙激活CREB途径MMP2的表达。实验目的1,探讨HUVECs中参与核钙信号调控的STIM1是否引起核钙依赖的CREB激活2,探讨HUVECs中参与核钙信号调控的STIM1是否能引起CREB依赖的MMP2基因表达增加实验方法实验分为两组,每组包括正常对照、空质粒、wt-STIM1、mt-STIM1、STIM1干扰、DMSO、CREB抑制剂。给予1μM组胺刺激,第一组为30min,第二组为60min。通过ELISA测量CREB活性,用Realtime PCR半定量MMP2的表达。实验结果1,实验分为正常对照组、空质粒组、野生型STIM1组、突变型STIM1组、STIM1干扰组、DMSO组、CREB抑制剂组。分别给予1μM组胺作用30min和60min。给予30min组胺刺激后以正常对照为1,空质粒组为1.083±0.08,野生型STIM1为1.167±0.22,突变型STIM1为1.244±0.144,STIM1干扰组为0.917±0.08,DMSO组为1.1656±0.168,CREB抑制剂组为0.924±0.080,各组活性无统计学差异。给予60min组胺刺激后以正常对照为1,空质粒组为0.974±0.03；野生型STIM1为1.128±0.07；突变型STIM1为1.564±0.09,CREB活性高于其他六组,p<0.01；STIM1干扰组为0.,615±0.04,CREB活性低于正常对照、空质粒、过表达野生型STIM1、过表达突变型STIM1、DMSO组,p<0.01；DMSO组为0.9±0.05;CREB抑制剂组为0.308±0.04,CREB活性低于其他六组,p<0.01。2,给予1μM组胺作用60min后比较各组MMP2mRNA量。以正常对照为1,空质粒组为1.023±0.02；野生型STIM1为1.03±0.03；突变型STIM1为1.233±0.029,其MMP2mRNA大于其他六组,p<0.01；STIM1干扰组为0.873±0.015,其mRNA低于正常对照、空质粒、野生型STIM1、突变型STIM1、DMSO组,p<O.01；DMSO组为1.017±0.019,CREB抑制剂组为0.76±0.03,其MMP2mRNA低于其他六组,p<0.01.实验结论1,STIM1能通过核钙信号调节CREB活性2,STIM1能通过核钙信号调节CREB活性从而影响MMP2基因表达