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背景随着分子免疫学及分子生物学研究的进展，人们对肿瘤发生、发展的分子机制有了深入的了解，认识到肿瘤的发生是一个多基因、多阶段、多步骤的渐进过程，但尚未找到肿瘤的特异突变或缺陷基因，人类肿瘤特异性免疫治疗的重要物质基础是肿瘤特异性抗原的存在。1991年van der Bruggen等发现黑色素瘤抗原(melanoma antigen，MAGE)MAGE-1以来，MAGE家族已经发现至少包括MAGE-A、B、C、D、E、F六个亚家族。MAGE-12基因属于黑色素瘤抗原基因(MAGE)家族中一员，MAGE-12是1994年Ding M等在人黑色素瘤细胞系DM150中被发现，且MAGE-12与MAGE-2、MAGE-3有高度的同源性，研究发现MAGE-12基因在肺癌细胞中有较高的表达率。MAGE-12基因编码一种肿瘤特异性抗原，在黑色素瘤、肺癌等其他多种肿瘤中均有不同程度的表达，而在正常组织中除睾丸和胎盘外均不表达，MAGE基因的发现立即成为肿瘤生物学治疗的热点。绿色荧光蛋白(GFP)是上世纪九十年代中期发展起来的一种全新的报告分子，最初是从多管水母(Aequoreavictoria)中发现的一种蛋白质，GFP能在多种生物，如细菌、粘菌、酵母、植物和哺乳动物中表达并产生荧光GFP分子量小，易于其它目的基因形成融合基因，对细胞无毒副作用，而且其化学性质稳定，使用方便，可以在活体细胞中定时观察，所以连接有GFP的载体pEGFP-C3在分子生物学中被广泛应用。目的应用RT-PCR技术，从人肺癌组织中扩增得到MAGE-12基因；构建MAGE-12基因的克隆载体pGEM-T easy-MAGE-12及绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12，并转染真核细胞(食管癌Eca109细胞)，观察其在真核细胞内的表达情况，为制备MAGE-12基因疫苗，并将其用于肿瘤的免疫治疗打下基础。材料与方法1．提取肺癌组织中的总RNA，应用RT-PCR方法，从中逆转录扩增出MAGE-12 cDNA基因片段，再PCR扩增得到MAGE-12基因片段，经过酶切鉴定后，克隆至载体pGEM-T easy，构建MAGE基因克隆载体pGEM-T easy-MAGE-12，转化入感受态细菌JM109后，进行蓝白筛选，挑选阳性克隆送上海生物工程公司进行行序列分析。2．测序证实碱基序列无误后，双酶切克隆载体pGEM-MAGE-12及真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3，构建MAGE12基因真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12，并转化入感受态JM109菌。3．挑选阳性菌落经酶切鉴定无误后，提取重组表达载体pEGFP-C3-MAGE-12，应用脂质体法转染至真核细胞(食管癌Eca109细胞)，在荧光显微镜下观察其在真核细胞中表达情况。4．提取转染有重组表达载体pEGFP-C3-MAGE-12真核细胞内总mRNA，应用RT-PCR技术，鉴定MAGE-12基因在真核细胞内的表达。结果1．以cDNA为模板，MAGE-12的两对特异性引物进行RT-PCR扩增，得到的扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，所得到的条带位于对照DNA marker近1000bp条带处，于预期的944bp的目的基因大小接近。经酶切鉴定，理论与实验结果相符。2．构建出MAGE基因克隆载体pGEM-T easy-MAGE-12。挑选阳性克隆，送生物工程公司测序后所获目的基因的序列，经计算机分析证实，与基因库中MAGE-12基因的2960—3904bp片段碱基序列完全一致。3．构建出MAGE-12基因真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12，经双酶切鉴定后，将该重组表达载体转染真核细胞，能够在真核细胞中广泛表达。4．经RT-PCR技术证实MAGE-12基因在真核细胞内成功表达。结论1．从人肺癌组织中成功扩增出MAGE-12基因，并构建MAGE-12基因克隆质粒pGEM-T-MAGE-12。2．测序结果经计算机软件分析，所克隆MAGE-12基因与GenBank中MAGE-12基因序列完全一致。3．成功构建MAGE-12基因真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MAGE-12，应用RT-PCR技术证实该重组子转染真核细胞后能够广泛表达，为将MAGE-12基因用于肿瘤的免疫治疗打下基础。