造影剂稳态磁化率MR灌注技术在胶质瘤血管生成及抗血管生成治疗的临床前期研究引言脑胶质瘤是临床最常见的原发性恶性脑肿瘤，它具有生长迅速、侵袭性强和高度血管生成的特点。过去几十年来，尽管胶质瘤的手术切除加术后放疗治疗方法不断改进，但其平均生存期仍然较差，只有12-18个月。血管生成是指从已存在的微血管床上通过内皮细胞的增殖、分化和迁移芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。血管生成对胶质瘤的生长和转移是必不可少的，其组织学特点为肿瘤内部分区域更高的血管密度和更大的管腔。因此抗血管生成药物当前在胶质瘤治疗中引起了极大的兴趣。MR灌注成像能够反映肿瘤的生物学特征，常常用于评估肿瘤的血管生成情况。近来，造影剂稳态磁化率MR灌注技术引起广大研究者的极大兴趣，由于它能够测量肿瘤血容量（BV）和微血管管径指数（VSI），从而获得肿瘤微循环的结构和功能信息，这也正是抗血管生成治疗发挥作用的靶点。本研究创新之处在于将最前沿的肿瘤发生和治疗机制与最新的影像学成像技术相结合，从分子影像学水平对肿瘤的发生、发展和治疗反应进行研究，并与组织病理学建立相关性，实现形态学与功能学并重。研究目的对正常鼠脑及脑胶质瘤动物模型进行造影剂稳态磁化率MR灌注成像研究，研究该成像技术评估正常及鼠脑胶质瘤微循环结构和功能信息的可行性；观察不同时间段鼠脑胶质瘤血管生成过程中微血管结构和功能变化，了解血管生成在胶质瘤发生发展中的作用；研究应用人重组内皮抑素进行抗血管生成治疗过程中鼠脑胶质瘤微血管形态学及功能改变。材料和方法1、大鼠C6脑胶质瘤模型的制备雌性Wistar大鼠77只，在立体定向仪上将呈对数生长期的C6细胞接种于大鼠右侧尾状核，接种坐标为冠状缝前1mm，矢状缝右侧3-4mm，进针深度为5.5mm，接种细胞量为5ul，细胞液浓度为1×10⁶个／ul。2、大鼠胶质瘤的抗血管生成治疗将荷瘤14天大鼠随机分成两组（治疗组和对照组），治疗组大鼠每天腹腔注射人重组内皮抑素10mg／kg；对照组每天腹腔注射相应量的生理盐水，共7天。3、MR灌注扫描将正常大鼠、荷瘤1、2、3周及经抗血管生成治疗后大鼠行造影剂稳态磁化率MR灌注成像。成像序列包括：注射造影剂前SE、GE和DWI以及经鼠尾注射造影剂后SE和GE序列。最后行Gd-DTPA T1WI增强扫描。4、参数计算感兴趣区（ROI）的设置：正常大鼠分别选取右侧皮质、胼胝体及尾状核区三个ROI；1周荷瘤大鼠选取肿瘤实质区及相应对侧正常脑实质区，其余荷瘤大鼠选取肿瘤周边区、中心区及对侧正常脑实质区。△R₂*和△R₂的计算：△R₂*（或△R₂）=（-1／TE）·[ln(SI_pre／SI_post]BV=3／（4π）·[△R₂*／（D／γ··△x·B₀）]VSI_MRI（um）=0.424（D／γ··△x·B₀）^1／2（△R₂*／△R₂）^3／25、组织病理学检查大鼠行MR检查后在麻醉状态下行肝素盐水心内灌注，然后再用4％中性多聚甲醛溶液心内灌注，立即断头取脑，以肿瘤为中心横断切片行HE染色及单抗CD34免疫组化染色。光镜下观察肿瘤形态，应用CD34免疫组化染色进行微血管半径(VSI_histo)的测量。6、统计分析采用SPSS11.5 for Windows统计学专用软件对资料进行处理，所有计量资料以（?）±s表示，不同区域间的参数比较采用非配对t检验，相关分析采用Spearman法，p＜0.05被认为有统计学意义，p＜0.01被认为有显著统计学意义。结果1、荷瘤大鼠生长情况移植后第二周部分大鼠出现轻度颅高压症状，表现为活动略减少，体重稍有下降。第三周症状明显加重，出现偏瘫，觅食及进食差，间歇性抽搐发作，可出现恶液质表现，并出现眶周出血。治疗组大鼠在治疗过程中未出现偏瘫、恶液质等症状，活动及进食水减少，体重略有下降。2、正常鼠脑及荷瘤大鼠的造影剂稳态磁化率MR灌注成像结果及其与组织学的相关性（1）正常鼠脑三个ROI的△R₂*和△R₂值与造影剂浓度改变明显呈正相关；实验表明当使用12mg／kg的造影剂剂量进行成像研究时，所测量BV的值更为接近组织学测量BV和VSI_MRI值更接近组织学测量值。（2）荷瘤2周大鼠的肿瘤中边区及中心区BV和VSI_MRI值分别为5.93±1.75％和4.64±1.92％以及10.34±3.21um和14.57±7.13um，与对侧正常脑组织相比有统计学差异（P＜0.05），与组织学测量结果比较周边区和中心区的相关性分别为0.884和0.825（P＜0.01）。（3）随种植周数的增加，肿瘤中心区的BV经历了先升后降的变化，与组织学上肿瘤中央区宿主血管退缩、血管密度下降及出现明显坏死区相关；周边区BV持续上升，与周边区具有活跃的血管生成相关。（4）随种植周数的增加，肿瘤中心区及周边区的VSI_MRI值均逐渐增大，以中心区增大更为明显，且同时间段比较二者之间有统计学差异。相同时间段、相同ROI内MR与组织学测量的VSI均明显相关（P＜0.01）。（5）人重组内皮抑素治疗后，治疗组与对照组肿瘤体积比较具有明显差异（P＜0.05）。治疗后肿瘤中心区及周边区BV和VSI_MRI值均有下降，以肿瘤周边区下降更为明显（P＜0.01），与内皮抑素对于肿瘤周边区（即血管生成活跃区）微血管的血管生成抑制作用更为明显相关。而肿瘤中心区BV下降无统计学意义，其机制较为复杂。结论1、正常鼠脑三个ROI的△R₂*和△R₂值与造影剂浓度改变明显呈正相关，从而也证明了该技术应用Monte Carlo模型的合理性。2、SPIO作为血池造影剂具有较长的血浆半衰期，其血液浓度能够较长时间保持恒定，从而保证了造影剂稳态磁化率MR成像的可行性；由于其具有较大的水合直径（＞30nm），使其难以通过破坏的血脑屏障泄漏至血管外细胞外空间，从而保证了造影剂稳态磁化率MR成像测量结果的准确性。3、造影剂稳态磁化率MR成像所测量的BV和VSI_MRI值能够准确的反映胶质瘤生长、发展过程中微血管生成的形态学和功能学信息。4、应用造影剂稳态磁化率对比MR灌注技术评估人重组内皮抑素治疗鼠脑胶质瘤是可行的，它能够准确反映治疗前后肿瘤血容量和微血管管径的变化。作为一种“广谱”抗血管生成药物，能够抑制大鼠C6胶质瘤的微血管生成过程，改善大鼠的生存质量。