前言糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3,GSK3β)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,调节细胞增殖与凋亡,微管动力学及细胞运动和血管生成。致瘤转录因子和癌蛋白作为GSK3p底物,由GSK3β磷酸化失活,抑制GSK3β的活性及表达诱导EMT,表明GSK3p在肿瘤发生和侵袭转移中发挥作用。p38MAPK是Mitogen Activated Protein Kinase(MAPK)家族的重要成员在细胞运动、肿瘤侵袭转移方面具有重要的调控功能。GSK3p位点的磷酸化状态调节GSK3β的活性,在N端丝氨酸9(Ser9)处磷酸化可降低GSK3p活性。GSK3β与p38MAPK存在一定关系,新近研究发现在鼠F9畸胎癌细胞,p38MAPK可以通过使GSK3β的N端丝氨酸9(Ser9)处磷酸化失活调节经典的Wnt信号通路。在胸腺和脑组织中p38MAPK可以通过直接磷酸化GSK3p的C端使其灭活,而且这一行为能导致p.catenin的聚集,这些表明GSK3β可能受p38MAPK的调控。有关GSK3β在乳腺癌体外的研究较多,抑制GSK3p的活性抑制乳腺癌细胞凋亡,促进Wnt信号通路的活化,提示GSK3β的失活促进细胞的恶性转化和肿瘤发展,但关于它在乳腺癌组织中的表达研究鲜见报道,p38MAPK可能磷酸化GSK3β促进其失活。本文研究p-GSK3β,p-p38和总的GSK3β在乳腺癌组织中的表达及和临床病理因素的关系,明确GSK3β在乳腺癌组织中表达的意义。材料和方法1、材料(1)临床资料80例乳腺癌组织蜡块取自中国医科大学第一临床学院病理科,为2005年-2008年手术切除标本。依据WH02003年所推荐的乳腺癌组织学分类标准进行分类,80例均为浸润性导管癌。收集50例外科手术切除新鲜乳腺组织标本,标本取出后立即置-70℃冰冻保存。其中30例为乳腺浸润性导管癌,20例为乳腺纤维腺瘤。(2)主要试剂兔抗人p-GSK3β-ser9多克隆抗体(sc-11757-R)购自Santa Cruz公司,鼠抗人p-p38单克隆抗体(#9216)购自Cell Signaling公司,兔抗人GSK3β(BS1402)多克隆抗体购自Bioworld Technology公司。S-P超敏免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。2、方法(1)免疫组织化学(S-P)法采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(S-P法)。PBS代替一抗作为阴性对照,用已知阳性片作阳性对照。(2) Western Blot取新鲜样品(约3mm3)加裂解液,剪碎,匀浆超声处理,高速低温离心提取上清蛋白,电泳,转印,经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。图像扫描,测定p-GSK3β、p-p38蛋白的灰度值。3、统计学分析采用SPSS for windows11.5统计学软件,进行χ2检验、t检验和Pearson相关分析。P<0.05有统计学意义。结果1、p-GSK3β、p-p38和GSK3β蛋白在乳腺癌组织中的表达及其同临床病理因素的关系(1)免疫组织化学结果显示,P-GSK3β蛋白主要位于乳腺癌细胞浆,呈棕黄色颗粒,阳性率为67.5%(54/80)。p-p38蛋白主要位于乳腺癌细胞核内,呈棕黄色颗粒,阳性率为60.0%(48/80)。p-GSK3β和p-p38蛋白表达与乳腺癌临床分期和淋巴结转移有关,与患者年龄和肿瘤大小没有关系,p-GSK3β蛋白与组织学分级有关(0.019)。56%的乳腺癌组织中GSK3β蛋白胞质表达消失,32.5%乳腺癌组织发现GSK3β蛋白核表达,胞核表达的GSK3β蛋白和乳腺癌的临床分期及ER表达有关。(2)Western Blot结果表明P-GSK3β和p-p38两种蛋白含量在乳腺癌组织与纤维腺瘤中的差异具有明显的统计学意义。2、乳腺癌组织中p-p38和p-GSK3β蛋白表达相关性分析p-p38表达阳性的48例乳腺癌组织中p-GSK3β表达阳性者36例；p-p38表达阴性的32例乳腺癌组织中P-GSK3β表达阴性者14例。统计学分析显示p-p38和P-GSK3β两者之间表达存在正相关(r=0.316,P<0.05)。讨论GSK3β抑制Wnt通路,调节细胞增殖和凋亡,在肿瘤的发生中发挥重要作用,体外研究表明在乳腺癌细胞系激活GSK3β促进细胞凋亡。Marganit Farago等通过基因修饰的方式抑制乳腺癌细胞系中GSK3β的活性,发现Wnt通路异常激活,促进乳腺肿瘤的发生。抑制GSK3β的活性诱导EMT,因此GSK3β失活可能促进肿瘤的发展。GSK3β在乳腺癌中的研究大多集中在体外,它在乳腺组织中的表达少见,我们选择失活的9位点磷酸化的GSK3β做研究发现p-GSK3β在乳腺癌组织中高表达,这与在肝癌和肺癌中的研究结果相一致,高表达的P-GSK3β与乳腺癌临床分期正相关,提示p-GSK3β促进乳腺癌的进展。Western Blot的结果也支持p-GSK3β在乳腺癌中表达高于纤维腺瘤。总的GSK3β在乳腺癌中表达下调,也提示乳腺癌中GSK3β的活性是受到抑制的。新的一些研究表明p38MAPK和GSK3β存在关联。在鼠胚胎癌中研究发现p38可以通过使GSK3β的N端丝氨酸9(Ser9)处磷酸化失活促进β-catenin在肿瘤细胞核中聚集。p-p38可能作为p-GSK3p的上游因子调节其表达,我们的研究表明p-p38和p-GSK3β在乳腺癌组织中表达呈正相关,提示p38MAPK可能通过失活GSK3p促进肿瘤发展。p38MAPK可能做为GSK3β的上游因子,上调p-GSK3β的表达,进而上调GSK3β调节的下游相关因子导致乳腺癌的恶性进展。p38MAPK信号通路抑制GSK3β的表达,我们的实验结果可为p38MAPK信号通路作为乳腺癌治疗的靶点提供理论依据。结论1、p-GSK3β和p-p38蛋白与乳腺癌临床分期及淋巴结转移有关,P-GSK3β与乳腺癌组织学分级有关。胞核表达的GSK3β与乳腺癌临床分期和ER表达有关。2、p-GSK3β和p-p38在乳腺癌组织中表达存在正相关。