【摘 要】
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目的:基因增强组织工程骨融合了基因治疗与组织工程技术的优点,在骨缺损修复领域具有良好的应用前景。本研究围绕基因投递方式,载体和种子细胞等因素进行优化选择,以系统评估目的基因经病毒或非病毒载体介导,通过体内/体外法进入口腔颌面部局部骨缺损后的修复效果,为其今后的转化应用提供一定的策略。材料和方法:1.分离培养兔脂肪干细胞（ASCs）,采用体外基因投递法,利用腺病毒载体感染ASCs使其过表达目的基因骨
【基金项目】
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国家自然科学基金（81170939,713364）； 国家重点研究基础发展计划（2012CB9336004）； 国家杰出青年科学基金（81225006）； 国际口腔修复学院（ICP）―“研究资助计划”；
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目的:基因增强组织工程骨融合了基因治疗与组织工程技术的优点,在骨缺损修复领域具有良好的应用前景。本研究围绕基因投递方式,载体和种子细胞等因素进行优化选择,以系统评估目的基因经病毒或非病毒载体介导,通过体内/体外法进入口腔颌面部局部骨缺损后的修复效果,为其今后的转化应用提供一定的策略。材料和方法:1.分离培养兔脂肪干细胞（ASCs）,采用体外基因投递法,利用腺病毒载体感染ASCs使其过表达目的基因骨形成蛋白2（BMP-2）,western blot,骨桥素（OPN）免疫荧光染色评估其体外成骨分化能力,将其负载到β-磷酸三钙（β-TCP）支架材料上构建基因增强的组织工程骨,用于兔即刻种植模型,采用序贯荧光标记和硬组织切片等评估体外间接投递法制备的基因增强组织工程骨实现种植体早期骨结合的能力。2.分离培养犬脂肪干细胞,采用体外基因投递法,利用腺病毒感染ASCs使其过表达BMP-2,Real-time PCR,碱性磷酸酶（ALP）和硝酸银染色（Von Kossa staining）评估其体外成骨分化能力,将其负载到β-TCP支架材料上构建基因增强组织工程骨,用于丝线诱导犬种植体周围炎的再生治疗,采用牙周探诊、临床附着高度、X-线等临床检测手段,和序贯荧光标记、硬组织切片等组织学方法评估体外间接投递法构建的基因增强组织工程骨促进炎性骨缺损修复和种植体-骨再结合的能力。3.体外法经非病毒载体PEI-LA转移目的基因至骨髓干细胞（BMSCs）,Real-time PCR,茜素红染色（alizarin red staining）检测靶细胞成骨分化能力,并将过表达BMP-2的BMSCs负载到明胶支架材料上构建基因增强组织工程骨;体内法直接将质粒-载体复合物（BMP-2/PEI-LA）负载到明胶上制备基因增强组织工程骨,两类基因增强骨均用于大鼠标准颅骨缺损模型的修复,采用免疫组织化学,micro-CT,硬组织切片,脱钙组织切片等方法系统评估、比较非病毒载体PEI-LA经体内/体外法转移目的基因,实现颌面部骨缺损快速再生的能力。结果:1、成功分离培养兔ASCs作为种子/靶细胞,腺病毒载体可成功介导目的基因BMP-2体外转移至ASCs,过表达BMP-2的ASCs表现出增强的成骨分化能力,与β-TCP负载的基因增强组织工程骨用于兔即刻种植模型,可明显促进种植体周围早期骨结合的形成。2、成功分离培养犬ASCs作为种子/靶细胞,经腺病毒载体体外转染BMP-2后表现出增强的成骨分化能力,与β-TCP负载制备基因增强组织工程骨用于犬丝线诱导种植体周围炎性骨缺损模型,可提升局部的骨再生,并明显促进种植体-骨再结合。3.成功分离培养大鼠BMSCs作为种子/靶细胞,经非病毒载体PEI-LA体外投递BMP-2基因后表现出增强的成骨分化能力;成功构建质粒-载体复合物。两者与明胶支架分别组合制备的体外/体内法基因增强骨均可促进大鼠颅骨缺损的修复。结论:病毒载体Ad经体外法可有效投递目的基因BMP-2至种子/靶细胞ASCs并提升其成骨分化能力,后者参与构建的基因增强组织工程骨可促进口腔颌面部种植体的早期骨结合,亦可实现种植体周围炎性骨缺损处的再结合;非病毒载体PEI-LA经体内/体外法均可制备基因增强组织工程骨实现目的基因的体内表达,促进颌面部骨组织缺损的快速修复。其中非病毒载体介导的目的基因体内直接投递,为基因增强组织工程骨治疗颌面部骨缺损的临床转化带了新的思路和策略。
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