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背景和目的非霍奇金淋巴瘤(NHLs)在所有的淋巴造血系统恶性疾病中占50%。NHLs是淋巴增生恶性病变中的一组异质性病变,其诊断和分类都是很复杂的。NHLs来源于B细胞和T细胞发育不同发育阶段的细胞的异常增生。大约90-95%的淋巴系统恶性疾病是B细胞来源。B细胞的发育主要发生在次级淋巴器官的淋巴滤泡。淋巴系统增生疾病一般是通过组织形态学、细胞形态学、免疫组化和流式细胞免疫表型来诊断的。虽然大多数病例可以做出诊断,但是偶然也有反应性增生病变和淋巴瘤难以区分。在这些病例中,Ig/TCR分子克隆研究可能是有用的方法。长期以来,SB分析是分子克隆分析研究的金标准。尽管SB分析的可靠性比较高,但它逐渐被PCR技术所取代,因为它有几个固有的缺陷:SB分析是费时的,有技术上的要求,需要10-20ug高质量的DNA,只有5-10%的有限的敏感性。PCR技术的最主要的优点是其快速,只需少量的DNA,并且可以使用较差质量的DNA,相对高的敏感性(1-5%),对于一些类型的重排,其敏感性甚至小于1%。并且PCR技术可以使用小的活检组织(例如:细针活组织检查获得的组织),可以使用福尔马林固定,石蜡包埋组织样本。而这些组织的DNA的质量通常是很差的,部分DNA已经降解成小的片段。而且,如果需要的话,归档的组织也可以用于PCR分析。在成熟的B-NHL中,PCR鉴定Ig和TCR基因重排是最重要的诊断工具。但是,PCR方案中引物设计没有标准化导致的假阴性和假阳性,阻止了其在先前的克隆研究中得到的数据的可比性。为了解决这个问题,制定一套可靠并且简易的用于可疑的淋巴增生疾病常规克隆诊断的PCR方案,欧洲7国47个机构参与了BIOMED-2concerted Action,发展了一套用于淋巴增生疾病诊断的多重PCR方案,来检测淋巴造血系统恶性病变中的Ig和TCR的克隆性重排和染色体转位:t(11;14)和t(14;18)。共设计了107条引物,放在18个多重PCR管中:三管VH-JH,两管DH-JH,两管Ig kappa(Igκ),一管Ig lambda(Igλ),三管TCR beta(TCRβ),两管TCR gamma(TCRγ),一管TCR delta(TCRδ),三管BCL1-IGH和一管BCL2-IGH。新鲜/冰冻组织被认为是最理想的用于PCR克隆分析的DNA样本。但是,对于诊断实验室和一些研究机构,不可能总能得到新鲜/冰冻组织,而石蜡包埋组织组成了大部分的样本来源。从石蜡中抽取的DNA的质量通常是很差的,所以在BIOMED-2 PCR方案在被广泛的用于诊断实验室之前,需要对PCR方案做出调整。对于克隆性重排阳性的病例,通过TA克隆测序可以观察其IgVH基因的突变情况,而检测IgVH基因的突变状况是追踪肿瘤发展阶段的一个有用的方法。我们研究的目的是应用BIOMED-2 PCR方案来检测福尔马林固定,石蜡包埋组织的B-NHL,并来检测BIOMED-2 PCR方案的有效性。通过克隆测序研究IgVH基因的突变情况。在淋巴瘤的随访过程中,通过PCR产物的长度和序列的变化来监测微小残留病变和疾病的发展。材料与方法1材料(1)NHL标本:收集1997-2008年我校医学院附属医院及省内其它医院的B-NHL标本75例,全部标本经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4～5μm连续切片,除常规HE染色外,采用LCA(2811,DAKO)、CD3(F7.2.38,DAKO)和CD20(L26,DAKO)免疫组化S-P法标记淋巴细胞亚群,根据肿瘤的免疫表型,确定为B-NHL,按照2001年WHO关于淋巴组织肿瘤的分类标准对所有病例进行分类,kappa light chain(L1C1,DAKO)和lambda light chain(LAM03+HP6054,DAKO)标记轻链。(2)对照组标本:阴性对照:收集反应性增生的扁桃体石蜡包埋的标本1例。阳性对照:Raji细胞系DNA和Jurkat细胞系DNA。2方法(1)经典蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蜡组织DNA。β-2微球蛋白鉴定抽提的DNA的质量。(2)采用BIOMED-2 PCR方案中的完全IGH基因重排,Igκ基因重排及TCRγ基因重排引物,检测75例NHL标本IG基因及TCRγ基因克隆性重排,产物先经2%琼脂糖电泳初筛后,行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。(3)克隆测序分析。结果1.采用BIOMED-2 PCR方案,75例B-NHL克隆性重排的检测率为85.3%(64/75)。其中IgH的检测率是78.7%(55/75),联合使用Igκ轻链,检测率是85.3%(64/75)。2.三例克隆阳性的病例测序结果:两例DLBCL一例用的VH3基因片段,一例用的是VH4基因片段,两例都存在体细胞超突变,但没有克隆内的突变;疑难病例中用的是VH3基因片段,两次发病的测序结果在IgHV3-21*02基因片段是一样的,因此二次发病有克隆相关性,是原病的复发;第二次发病在IgHV3-30*03基因片段出现了一个新的克隆,疾病有新的进展。结论1.对高度怀疑为淋巴瘤的标本进行克隆性重排检测时,同一样本必须同时进行IgH和TCR基因重排的检测,才能保证结果的完整性和真实性,两者缺一不可。2.BIOMED-2的PCR方案适合于福尔马林固定,石蜡包埋组织。3.因为石蜡包埋组织中抽提的DNA的PCR扩增产物的长度绝大多数小于300bp,更多的是小于200bp,所以应选择IgH-FR2(tube C),Igκ(tube A),Igκ(tube B),TCRγ(tube A)和TCRγ(tube B)。4.进一步修改BIOMED-2方案可以提高克隆检测率。5.克隆阳性的的病例测序可以分析IgVH基因的突变情况,分析其分子特征,追踪疾病的发展。