第一章VPO1在不同周龄自发性高血压大鼠血管重构中的作用及机制研究背景高血压(]Hypertension)是一种以体循环动脉收缩期和(或)舒张期血压持续升高为主要特点的全身性疾病,其主要病理改变是血管重构和左心室肥厚,涉及实质细胞(如心肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞)和间质细胞(如心肌成纤维细胞、细胞外基质)的改变,引起心肌细胞体积增大和间质增生,加上由于高血压时血管阻力增加引起左心室后负荷相应的增加,导致左心室肥厚,疾病进一步恶化可导致左心衰竭；在血管表现为内皮细胞功能不全、平滑肌细胞增生肥大和细胞外基质沉积等。血管重构和左心室重构是高血压发生发展过程的中心环节。大量研究表明氧化应激(Oxidative stress)是高血压血管重构和左心室重构的主要机制之一。氧化应激是指机体活性氧(Reactive oxygen species, ROS)过量蓄积引起的氧化损伤。NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)和过氧化物酶是血压调节中产生活性氧的重要来源。血管过氧化物酶1(Vascular peroxidasel, VPO1)是新近报道的一种主要存在于心血管系统中的含有血红素的过氧化物酶。已有研究表明VPO1类似于髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO),能将H2O2(弱氧化剂)催化成为HOCl (强氧化剂),促进机体细胞损伤。故推测VPO1可能在氧化应激中发挥重要作用。本章选取不同周龄SHR与同周龄WKY大鼠模型对比,观察VPO1表达与胸主动脉及肠系膜动脉血管重构及氧化应激程度的关系,以及氯沙坦处理对高血压大鼠血管重构的影响以及其可能涉及的机制。方法选取4周龄雄性体重在65-85g/只的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR),适应饲养1周后,48只SHR大鼠随机分为6组进行饲养,每组8只,同时选取周龄、性别、体重匹配的Wistar-Kyoto大鼠(WKY)32只作为对照组：①5周龄(week-old, wks)的SHR和WKY组(SHR5和WKY5)②8周龄SHR和WKY组(SHR8和WKY8)；③13周龄SHR和WKY组(SHR13和WKY13)；④20周龄SHR和WKY组(SHR20和WKY20)⑤低剂量Losartan组(15mg/kg/day, Los(L));⑥高剂量Losartan组(30mg/kg/day,Los(H))。其中Los(L)组和Los(H)组SHR大鼠从13周龄开始给予上述剂量的氯沙坦(Losartan)灌胃,SHR组及WKY组给予等体积的生理盐水灌胃,动物每周称重,以调整给药量。常规喂养至20周龄后终止实验。经左颈总动脉插管测定大鼠动脉收缩压(Systolic blood pressure, SBP),收集血液并测定血浆中血管紧张素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ, AngⅡ)、过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)的浓度。测定主动脉组织匀浆中NADPH氧化酶(NOX)活性,分别提取肠系膜动脉组织RNA、胸主动脉RNA和蛋白；用Real-timePCR和Western Blot检测VPO1的表达；4%多聚甲醛固定胸主动脉、肠系膜动脉,石蜡包埋,用于苏木精-伊红(HE)和Masson染色以及免疫组化等形态学实验。结果1.与同周龄WKY大鼠比较,SHR8、SHR13、SHR20大鼠血压显著升高,SHR13、SHR20大鼠胸主动脉及肠系膜动脉血管重构明显;2.与同周龄WKY大鼠比较,SHR8、SHR13、SHR20大鼠血浆AngⅡ、H2O2水平显著升高(P<0.05),主动脉组织匀浆NADPH氧化酶活性明显增高,且SHR20大鼠升高幅度更大；3.与同周龄WKY大鼠比较,SHRg、SHR13、SHR20大鼠肠系膜动脉组织中VPO1的mRNA水平,以及胸主动脉组织中VPO1的mRNA和蛋白表达水平明显上调；4. Losartan干预呈浓度依赖性降低自发性高血压大鼠的血压,逆转血管重构,同时降低SHR大鼠血浆中H2O2的浓度,降低主动脉组织中NOX活性,降低VPO1蛋白表达。结论1.高血压大鼠血管重构的机制与氧化应激程度升高有关；且VPO1表达上调与血管重构相关,其机制可能涉及NOX/VPO1途径；2. Losartan具有抗高血压大鼠血管重构的作用,其机制可能与抑制NOX/VPO1途径,使氧化应激程度减轻有关。第二章VPO1在不同周龄自发性高血压大鼠左室重构中的作用及机制研究背景心肌重构(myocardial remodelling)是指在多种病理情况下(如压力超负荷、缺血、高肾素水平等)心肌组织作出的适应性反应,包括心肌细胞肥大、间质纤维化、心肌细胞凋亡等。高血压早期的重构在短期内对正常心功能的维持具有一定的积极作用,但长期持续的重构会导致心功能逐渐恶化以至失代偿而出现心力衰竭。新近研究表明,氧化应激在高血压左心室重构中发挥重要作用。机体内活性氧的大量蓄积和/或抗氧化能力的降低导致氧化应激损伤。机体内产生ROS的酶系主要包括NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、单胺氧化酶等。VPO1作为新发现的含血红素的过氧化物酶家族成员之一,其主要在心血管系统中表达,鉴于其具有将H2O2(弱氧化剂)催化生成HOC1的特性,本章节继续以不同周龄的自发性高血压大鼠为模型,探讨VPO1在高血压心肌重构中的作用及机制；并探讨氯沙坦抗心肌重构的作用及机制。方法基于第一章中动物实验分组,①SHR5和WKY5,②SHR8口WKY8、③HR13和WKY13,④HR20和WKY2o>⑤Los(H),⑥Los(L)等6组动物在最终处理前完成超声心动图观察心脏结构的形态及心功能指标；分离全心脏并称重(Heart weight, HW)、游离左心室并称重(Left ventricular weight, LVW),游离大鼠右侧胫骨并测量其长度(Tibia length, TL),计算LVW/HW和LVW/TL比值。4%多聚甲醛固定左心室,石蜡包埋,用于苏木精-伊红(HE)和Masson染色以及免疫组化等形态学实验；分别提取左心室组织RNA和蛋白,用Real-time PCR检测心肌肥大标志物脑钠素(brain natriuretic peptide, BNP)、α-骨骼肌动蛋白(a-skeletal actin, a-SA),β-肌球蛋白重链(P-myosin heavy chain, β-MHC) mRNA表达的变化；检测心肌纤维化标志物Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagen Ⅰ, collagen Ⅲ)和结缔组织生长因子(CTGF) mRNA表达的变化；检测心肌凋亡指标Bax和Bcl-2。测定左心室组织匀浆中次氯酸(hypochlorous acid, HOC1)、H2O2的浓度、NADPH氧化酶(NOX)的活性；Western Blot检测NOX2、VPO1的表达。结果1.与同周龄WKY大鼠比较,SHR8、SHR20大鼠血压显著升高,SHR13、SHR20大鼠舒张末期左室后壁和室间隔显著增厚,左室舒张功能下降,收缩功能无明显变化；2.与同周龄WKY大鼠比较,SHR13、SHR20大鼠胶原沉积明显增多,BNP、α-SA、β-MHC、Ⅰ、Ⅲ型胶原、CTGF以及Bax的mRNA表达显著上调,Bcl-2显著下调；3.与同周龄WKY大鼠比较,SHRg8、SHR13、SHR20大鼠左心室组织匀浆中HOCl、H2O2浓度和NOX活性显著上调,且NOX2、VPO1的mRNA和蛋白表达明显上调；4.与对照组比较,Losartan干预呈浓度依赖性抑制自发性高血压大鼠的左心室重构,同时降低SHR大鼠中左心室组织中HOCl、H2O2浓度和NOX活性,降低NOX2和VPO1蛋白的表达。结论1.高血压大鼠左室重构,其机制可能与氧化应激程度升高有关,且VPO1表达与左室重构相关,其机制可能涉及NOX/VPO1途径；2. Losartan具有抗高血压大鼠左室重构的作用,其机制可能与抑制NOX/VPO1途径,使氧化应激程度降低有关。第三章VPO1在不同周龄自发性高血压大鼠内皮功能中的作用及机制研究背景高血压是心血管疾病的主要危险因素,越来越多的证据表明活性氧(ROS)的大量蓄积引起氧化应激是高血压的主要发病机制。高血压中心脏、肾脏和中枢神经系统产生ROS的酶系有黄嘌呤氧化酶、未偶联型一氧化氮合酶(NOS)、线粒体呼吸酶和NADPH氧化酶(NOX)。心血管系统中产生ROS的主要来源是NOX,它能催化产生超氧化物及下游其他活性氧。NOX家族成员共有7种催化亚单位,即NOX1-5和Duox1和Duox2(双氧化酶)。到目前为止,证实在哺乳动物的心血管系统中NOX催化亚单位主要是NOX2和NOX4。过氧化物酶在体内分布广泛,具有高度细胞/组织分布特异性。它参与宿主的防御反应,参与生物合成甲状腺激素、细胞外基质等,在病理条件下能催化过氧化氢(H202)和氯离子产生次氯酸,从而氧化蛋白质、脂质和DNA,导致细胞和组织。一氧化氮(NO)是内皮型一氧化氮合酶(eNOS)产生的血管舒张因子,维持着血管的舒张功能。eNOS合成和/或生物利用度降低导致内皮功能障碍,而血管内皮功能障碍是高血压导致靶器官损害及其并发症发生的重要原因。血管过氧化物酶1(VPO1),新发现的过氧化物酶家族成员,在心血管系统中,它主要在血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞中表达。VPO1酶学和底物特异性类似MPO,即在弱氧化剂H2O2催化生成强氧化剂次氯酸,促进血管组织的进一步氧化应激。上述章节已经得出结论VPO1涉及高血压的发展,本章节继续以不同周龄自发性高血压大鼠为模型,探讨随着高血压的进展,NADPH氧化酶活性的状态、ROS的产生、氧化应激程度以及VPO1是否涉及内皮功能障碍。方法基于第一章中动物实验分组,6组动物：①SHR5和WKY5组；②SHR8和WKY8组；③SHR13和WKY13组；④SHR20和WKY20组；⑤Los(L)组;⑥Los(H)组,每组8只,颈总动脉插管测压后收集动脉血,测定血浆中一氧化氮(nitric oxide, NO)、过氧化氢(hydrogen peroxide、H2O2)浓度,游离胸主动脉测定血管内皮依赖性舒张反应,提取胸主动脉组织中RNA和蛋白,测定组织匀浆中的次氯酸(hypochlorous acid, HOC1)3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine)的浓度、NADPH氧化酶(NOX)活性,用Real-time PCR或Western Blot检测NOX4、eNOS、VPO1的表达。结果1.与同周龄WKY大鼠比较,SHR8、SHR13、SHR20大鼠血压显著升高,SHR13、SHR20大鼠出现内皮依赖性舒张功能不全；2.与同周龄WKY大鼠比较,SHR8、SHR13、SHR20大鼠血浆中H202浓度升高,胸主动脉匀浆中HOCl、3-硝基酪氨酸的浓度、NOX的活性以及NOX4mRNA和蛋白表达显著升高；3.与同周龄WKY大鼠比较,SHR8、SHR13SHR20大鼠血浆NO浓度、eNOS mRNA和蛋白表达显著降低；4. Losartan干预呈浓度依赖性降低大鼠胸主动脉匀浆中HOCl、3-硝基酪氨酸的浓度、NOX的活性,降低NOX4和VPO1的表达,升高血浆中NO浓度和eNOS的表达,改善血管内皮舒张功能。结论1.高血压可导致血管内皮功能不全,其机制与氧化应激程度升高有关；2.VPO1与高血压大鼠内皮功能不全相关,其机制可能涉及NOX/VPO1途径；3. Losartan降压并降低氧化应激程度,降低VPO1的表达,改善血管内皮功能。