番茄(Solanum lycopersicum)叶绿体外膜转运子基因的克隆与表达分析

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质体最初起源于通过内共生整合到寄主细胞中自由生长的蓝藻菌,在植物细胞中执行基本代谢和信号转导。植物中存在许多不同类型的质体,如叶绿体,有色体,白色体,造粉体等。据统计,大约95%(约1900-2500个)的质体蛋白质在细胞核里编码,以前体蛋白的形式存在于细胞溶质中,翻译后导入到细胞器中。叶绿体外膜转运子(Transloconsat the outer envelope membranes of the chloroplast, Toc)是一种GTPase,负责调控细胞核编码蛋白质的识别与初始导入。Toc GTPase首先在豌豆中被鉴定,近年来,多数研究集中在拟南芥上。番茄基因组测序的完成,为在番茄中鉴定叶绿体导入成分Toc GTPase基因提供可能。本研究以番茄(Solanum lycopersicum cv. Heinz-722)为试验材料,首次从番茄物种中鉴定并分析了6个Toc GTPase基因(slToc34-1,slToc34-2,slToc159-1,slToc159-2,slToc159-3和slToc159-4);成功克隆了3个Toc GTPase基因(slToc34-1,slToc34-2, slToc159-2);用实时荧光定量qPCR方法分析了6个Toc GTPase基因在番茄的子叶、花芽、开放当天的花、幼叶、绿果、红果、根等组织中的特异性表达;研究了NaCl盐分胁迫下,含ACC脱氨酶的植物生长促生菌(PGPR)Pseudomonas putida UW4细菌对5个番茄Toc GTPase基因表达量的影响及对番茄植株长势的影响。主要研究结果如下:1.以拟南芥的叶绿体外膜转运子蛋白atToc159和atToc34的氨基酸序列为模板,在番茄基因组数据库中查找到6个番茄叶绿体外膜转运子蛋白(Toc GTPase)的同源物,分别命名为slToc159-1,slToc159-2,slToc159-3,slToc159-4和slToc34-1,slToc34-2,经同源序列分析得出番茄slToc159家族与拟南芥atToc159家族有20.0%-48.7%的氨基酸序列同源性,番茄slToc34家族与拟南芥atToc34家族有53.3%-58.2%的氨基酸序列同源性。说明对叶绿体外膜蛋白导入系统的进一步研究,番茄将是一个新的有效模式植物。2.通过同源克隆的方法,成功克隆出3个番茄Toc GTPase基因:slToc34-1,slToc34-2和slToc159-2。slToc34-1cDNA编码区780bp,编码259个氨基酸,预测蛋白分子量为28.7kDa;slToc34-2cDNA全长906bp,编码301个氨基酸,预测蛋白分子量为33.7kDa;slToc159-2cDNA编码区2535bp,编码844个氨基酸,预测蛋白分子量为92.9kDa,为进一步功能研究奠定基础。3.用实时荧光定量qPCR的方法研究6个番茄Toc GTPase基因在番茄子叶、花芽、开放当天的花、幼叶、绿果、红果、根等组织中的表达,结果表明:slToc34-1和slToc34-2在非光合组织(绿果、红果、根)中表达量高;slToc159-1和slToc159-4在光合组织(幼叶、花芽、开放当天的花、绿果)中表达量高,slToc159-2在光合组织和非光合组织中表达量没有明显区别,slToc159-3仅在根、绿果、花芽中表达。4.不同NaCl盐分浓度胁迫下,PGPR P. UW4细菌对5个番茄Toc GTPase基因不同时期表达量及对番茄植株长势的影响,结果表明:盐分胁迫下,接种UW4植株的5个Toc GTPase基因表现上调,并且得出P. putida UW4促进番茄生长的关键时期是盐分胁迫后的第六周;接种P. putida UW4的植株与对照相比,植株的株高、鲜重、干重和叶绿素含量明显提高。
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