【摘 要】
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目的:确定利用无血清悬浮培养法获取结肠癌肿瘤干细胞的最佳生长因子浓度、组合方案及培养时间。以期建立“富集结肠癌肿瘤干细胞技术模型”,为针对结肠癌肿瘤干细胞的基础研究、临床研究、靶向治疗研究提供重要的理论支持。方法:在含有不同浓度组合的表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF
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目的:确定利用无血清悬浮培养法获取结肠癌肿瘤干细胞的最佳生长因子浓度、组合方案及培养时间。以期建立“富集结肠癌肿瘤干细胞技术模型”,为针对结肠癌肿瘤干细胞的基础研究、临床研究、靶向治疗研究提供重要的理论支持。方法:在含有不同浓度组合的表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF）的无血清培养基（serum-free medium,SFM）中悬浮培养结肠癌DLD-1细胞,获得球细胞。设置培养时间梯度为10天,20天,30天,根据不同浓度组合的EGF和bFGF将实验分为9个组。对各个实验组分别采用流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测细胞球中的 CD44+、CD133+及CD44+CD133+双阳性的球细胞表达比例;Real-time PCR检测球细胞中肿瘤干性相关基因（KLF4、Lgr5、CD44、CD133）,上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）基因（E-cadherin、Vimentin）以及Wnt/β-catenine信号通路基因（Wnt-3a）的mRNA表达变化;成球实验（Sphere-forming assay）检测球细胞球的自我更新能力;平板克隆实验（Colony formation assay）检测球细胞的体外成瘤能力;裸鼠皮下成瘤实验检测球细胞的体内成瘤能力。结果:流式细胞术（Flow cytometry,FCM）分析:CD133+、CD44+细胞均以G9组（20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF）30天表达比例最高（F=123.554,99.528 P＜0.001）,CD133+CD44+双阳性细胞表达比例以 G9组30天表达比例最高（除外G3组10天及G6组20天）（F=5 7.897,P＜0.001）;Real-time PCR检测各组球细胞的mRNA相对表达结果:KLF4、Lgr5、CD44、CD133、Vimentin 及 Wnt-3a 均以 G9 组 30 天表达量最高（F=22.682,25.401,3.272,7.852,13.331,17.445 P＜0.001）,E-cadherin以 G9 组 30 天表达量最低（F=10.851,P＜0.001）;Sphere-forming assay 结果以G9组30成球实验球细胞数量最多（F=19.147,P＜0.001）;Colony formation assay 结果也以 G9 组 30d 细胞数量最多（F=60.767,P＜0.01）;G9组30天的球细胞在裸鼠皮下成瘤实验中得到的瘤体体积最大（F=12.539,P＜0.01）。结论:20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF在悬浮培养30天时,能有效富集结肠癌肿瘤干细胞,且较其余组合效率最高。
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