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凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾,肉嫩味美,营养丰富,深受国内外消费者的喜爱。凡纳滨对虾以鲜销和冷冻加工为主,其中鲜活虾大约是冷冻虾价格的两倍,因此凡纳滨对虾的保活运输具有重要的经济价值。凡纳滨对虾的活体运输方法主要有带水运输和无水运输。无水保活运输由于操作简便,运载量大,成本较低,有利于远距离的运输,具有广阔市场前景。无水运输可以通过低温或使用麻醉的方法使水产品进入休眠状态实现。单纯低温胁迫下水产品易出现应激性损伤且猝死率较高,大多数麻醉剂的使用存在安全性问题。二氧化碳(CO2)具有无毒与安全性高等优点,被广泛应用于水产品无水保活研究中。本文通过低温与CO2联合胁迫凡纳滨对虾研究其无水保活技术,首先采用响应面方法对凡纳滨对虾无水保活最佳处理条件进行优化,然后对凡纳滨对虾无水保活过程中的糖酵解关键酶以及相关免疫指标进行测定,最后利用差异蛋白质组学对凡纳滨对虾保活过程中肌肉蛋白的表达变化进行研究。主要研究内容及结果如下:(1)通过Box-Bohnken设计3因素3水平的响应面试验,研究初始温度(A)、CO2浓度(B)、保活时间(C)等因素对凡纳滨对虾无水保活存活率的影响。结果表明,温度与p H之间的交互作用对凡纳滨对虾无水保活存活率的影响显著(p<0.05),温度与保活时间、p H和保活时间之间的交互作用对凡纳滨对虾无水保活存活率影响不显著(p>0.05);在保活时间为8 h的条件下,最佳无水保活处理条件是:温度为18.2℃,p H 6.08,存活率为86.4%,所得实际值与理论值的误差为4.63%。(2)使用比色法与细胞计数仪测定未处理(对照)、无水保活和复苏3种状态下,凡纳滨对虾葡萄糖(Glu)、乳酸(LD)及鳃中3种糖酵解关键酶、有氧代谢和无氧代谢关键酶、免疫相关酶及血淋巴细胞总数(THC)变化。结果显示:无水保活中对虾Glu浓度低于对照组,LD浓度则显著高于对照组;己糖激酶(HK)、果糖磷酸激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)这3种糖酵解关键酶活力均高于对照组;反映有氧代谢水平的琥珀酸脱氢酶(SDH)活力持续降低,代谢无氧代谢水平的乳酸脱氢酶(LDH)则相反;对虾THC随着保活时间延长下降,超氧化歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活力不断上升。复苏后,HK、PK、SOD和POD恢复到对照组水平,Glu、LD、PFK、SDH、LDH和THC均与对照有显著差异。无水保活过程中,凡纳滨对虾糖酵解加快以及无氧代谢加强,同时体液免疫功正常发挥作用,无水保活8 h未造成其代谢及免疫功能紊乱。(3)采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对保活前后的凡纳滨对虾肌肉进行定量蛋白质组学研究。提取的肌肉蛋白质样品经FASP酶解、同位素标记、第一维p H-RPLC分离、第二维RPLC-MS分离分析,获取的串联质谱数据通过Protein Pilot 5.0软件搜库进行蛋白质鉴定,通过蛋白质相对定量的比较寻找差异表达蛋白;再对差异蛋白质进行GO、KEGG代谢通路分析。实验共鉴定具有定量信息蛋白质2670个;与对照组相比,实验组上调蛋白质150个,下调蛋白质20个;经过生物信息学分析得到26个目标差异蛋白,主要分为6类:与糖原分解、糖酵解、TCA循环、氧化磷酸化、ATP分解与合成以及与应激相关的蛋白。结果显示:相对于对照组,实验组中与糖原分解相关的6种蛋白质表达均为上调,与糖酵解相关的种蛋白质表达呈现上调趋势,与TCA循环以及氧化磷酸化相关的12种蛋白质表达均为下调,与免疫应激相关的4种蛋白表达量上调。由此可知无水保活过程中凡纳滨对虾有氧代谢减弱,无氧代谢占主导地位,机体抵抗不良环境的能力得到了增强。