泛素-蛋白酶体降解系统一直是胞内用来清除异常的蛋白质和选择性降解各种生化过程中调控蛋白的执行者，它可以降解错误折叠的蛋白也可以及时更新细胞周期过程中的调控因子，对细胞的各种生化过程进行精密的调节，从而可以将胞内的蛋白质总量维持在一个相对恒定的水平，保证正常生命活动的规律性[1-3]。 芽殖酵母的RPN4(RegulatingParticleNoneATPase-4)基因，亦称SON1和UFD5，最开始是作为温度敏感株的抑制子Suppressor被发现的，即PRN4的失活突变可以恢复sec63-101在限制温度下的生长缺陷。后来发现，RPN4基因的突变还可以稳定泛素融合底物(UFDpathway的底物)UB-Vβgal，在不影响其多聚泛素化的情况下，阻碍26S蛋白酶体对它的降解，因此亦被命名为UFD5。 以前的研究表明在蛋白酶体的32个亚基中有26个基因的上游启动子区域含有PACE(Proteasome-associatedcontrolelement)序列，而RPN4正是这段顺式转录元件的反式转录因子，并且其自身的降解也必须靠蛋白酶体来实现。这暗示了一种负反馈调控机制的存在：RPN4上调蛋白酶体亚基的水平，上调的亚基组装成有活性的蛋白酶体又反过来降解自身的转录激活因子，从而将其下游转录产物——蛋白酶体亚基维持在一个相对恒定的水平，保证细胞正常的生命活动。 本论文的结果提供了直接的证据证明负反馈调控机制的存在，首先在两种不同的蛋白酶体活性受损的菌株内观察到RPN4蛋白的半衰期大大延长，稳定性明显升高，随后检测受其调控的下游蛋白酶体亚基的水平，发现与野生型相比，在蛋白酶体活性受损的突变型酵母菌株内其各个亚基的丰度都有大幅度提高，Northern检测证实这种升高是由转录水平的增强引起的并且随着RPN4稳定性的增加而增加。这些结果都表明在蛋白酶体活性受损的菌株内由于对RPN4的降解能力减弱，增加了RPN4在细胞内的丰度，上调了其各个亚基的转录水平，从而在数量上对胞内受损的蛋白酶体给与补充，使其达到新的动态平衡，维持细胞正常的蛋白酶体活力水平。之后我们做了大量的酵母菌株表型测试试验，结果与预想的一致，在蛋白酶体单亚基突变造成的活性受损菌株中酵母的存活率与生长速度都与野生型相差无几，但是当在实验中同时损伤蛋白酶体的活性并去除RPN4介导的负反馈调控机制之后，菌株就表现出强烈的合成致死效果，存活率大大降低，生长速度也十分缓慢，可见在RPN4缺失的情况下，受损的蛋白酶体无法在数量上得到补给，给菌株的生长带来了毁灭性的灾害。此外，为了研究蛋白酶体各个亚基对上游转录因子RPN4的应答，我们选用位于20S核心颗粒的不同亚基做标记，正是这个偶然的机会使我们发现当采用目前普遍使用的纯化26S蛋白酶体的方法来做体外活性实验时，其蛋白酶体的活性在纯化过程中就已经受到了损伤，从表型上看，在RPN4缺失的情况下，26S蛋白酶体的表达量虽然不如野生型，但是仍然可以足够维持酵母细胞的存活和生长，如果同时在蛋白酶体亚基PRE2的末端加上TAG，就严重影响了菌株的存活率和生长速度，表现出强烈的合成致死。说明由末端加上TAG的PRE2组装的26S蛋白酶体的活性已经大大不如野生型，这些结果都为将来的蛋白酶体体外活性实验提供了很好的指导。由于最新的报道表明，26S蛋白酶体以及一些RPN4的下游基因都参与了DNA的修复过程，这种相关性使我们想进一步探求在DNA损伤试剂的作用下，RPN4-蛋白酶体负反馈调控机制是否在整个DNA复制后修复过程中起了关键的作用。实验结果证明，在MMS作用之后，蛋白酶体的活性有所损伤，但是其在细胞内的丰度明显增加，并且这种增加表现出强烈的RPN4依赖性。有可能在DNA损伤试剂作用之后，很多压力敏感的蛋白由于表现异常，无法形成正确的构象执行功能，需要被26S蛋白酶体降解。而RPN4正是介导了在此应激状态下蛋白酶体总量最大程度的提高。 鉴于酵母细胞内蛋白酶体的总量始终受以RPN4为核心的负反馈机制的调控，所以对转录因子RPN4降解途径的研究就显得尤为重要。之前的工作表明，RPN4存在两条相互独立且蛋白酶体依赖的降解途径，一条是与底物的多聚泛素化有关的泛素依赖性降解，而另一条则是与N端的前10个氨基酸有关的泛素非依赖性降解。为了将底物的这两条降解途径分开，我们在已经报道的15种E3缺失突变的酵母菌株中表达了去除其泛素非依赖性降解信号的底物——N端缺失的RPN4，结果显示只有在ubr2△的酵母菌株中才能够检测到底物的存在，相应的Pulse-chase试验结果也表明，UBR2的缺失致使细胞中的底物蛋白完全稳定了。之后，当我们用全长的RPN4做同样的实验时也得到了类似的结果，虽然全长蛋白的泛素非依赖性降解途径仍在继续，但是由于其泛素依赖性降解途径的阻断，蛋白底物的半衰期大大延长，稳定性有明显的提高。据此推测UBR2极有可能参与了RPN4的多聚泛素化降解过程。根据以前酵母双杂交实验的报道，UBR2可以与N-endrule信号通路的E2-RAD6相互结合，因此我们推测RAD6极有可能在RPN4的泛素依赖性降解途径中也行使E2的功能。从理论上讲，含有RING结构域的E3可以作为媒介将E2与底物蛋白在空间上聚拢在一起，以最优化的方式使底物直接从E2获得Ubiquitin。为了证实以上对RAD6蛋白功能的推测，我们做了免疫共沉淀实验，结果表明RAD6和底物RPN4都可以与UBR2发生特异性结合，而且在RAD6△的菌株内，N端缺失的RPN4蛋白泛素依赖性降解途径也被完全阻断了。这些实验结果都从不同的侧面向我们描绘出细胞内RPN4多聚泛素化反应的基本过程，为了证实以上所有对RPN4降解途径的推测，我们在体外重建了整个泛素化反应过程，发现只有在E1，RAD6，UBR2，RPN4都存在的情况下，才可以看到多聚泛素链形成。说明底物RPN4的多聚泛素化反应确实需要特异的E3-UBR2的参与。 由于蛋白酶体的丰度和活性大小与酵母细胞的生长状况密切相关，而RPN4又是蛋白酶体亚基转录所必需的反式转录因子，所以酵母细胞内UBR2的缺失必然会导致RPN4的降解受到抑制，在细胞内的丰度增加，从而进一步促进下游26S蛋白酶体的转录，提高其在细胞内的整体水平。为了研究RPN4的累积对酵母细胞生长的影响，我们做了菌株的表型测试，结果发现无论是否在野生型还是在UBR2缺失型的酵母中过量表达RPN4，菌株的生长速度和存活率都没有明显的差异。推测可能是因为泛素非依赖性降解途径的存在，使得由UBR2缺失而稳定的RPN4又很快在细胞内被26S蛋白酶体降解，所以无法发挥转录因子的作用；又或者酵母细胞本身就可以在正常的生长条件下忍受高于普通水平的RPN4和蛋白酶体。之后，为了进一步确证在蛋白酶体活性受损的情况下，累积的RPN4是否会对酵母细胞的生长产生影响。我们在蛋白酶体活性受损以及同时伴有UBR2缺失的酵母菌株内过量表达RPN4，发现其生长速度和存活率都明显低于同源的野生型菌株，并且这种表型的缺陷呈现出很强的RPN4剂量依赖性。相比之下，在同样背景的酵母菌株内过量表达丧失了转录活性的RPN4(C477A)，由UBR2缺失而稳定的RPN4却没有对菌株的表型产生任何影响。所有这些结果都证明在蛋白酶体活性受损的菌株内UBR2缺失引起的RPN4蛋白的累积对菌株生长的毒性，有可能是由其下游的转录产物-受损的蛋白酶体亚基引起的，这些功能有所欠缺的蛋白酶体也许无法及时地将那些从底物上切除的多聚泛素链释放到细胞质中成为可被循环利用的自由的Ubquitin，所以打破了细胞内合成与降解的平衡，使得很多对细胞有毒性的蛋白以及调控细胞周期的蛋白无法得到及时的降解，造成细胞的死亡。当然具体的毒性机制还有待进一步的后续研究。