纳米纤维基比色生物传感器的制备及其抗生素检测应用

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抗生素因具有选择性抑制或杀灭其它菌种微生物的能力,而被广泛应用于医疗、农业及畜牧养殖业,尤其是随着集约化畜牧业的发展,使用抗生素己成为保障畜牧业持续健康发展所必不可少的核心环节。由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使,养殖业成为了四环素、氨基糖苷等各类兽用抗生素滥用的重灾区。抗生素滥用的直接后果是导致其在动物源性食品中的残留,后经食物链在人体内蓄积,引发过敏和变态反应、损伤神经系统、抑制骨髓造血机能、导致耐药菌株感染等危害。当前,抗生素耐药性细菌已蔓延至全球各地,如不采取行动对滥用进行干预,人类将“无药可救”。世界卫生组织也将抗生素滥用视为国际关注的重大问题之一,对相关重点抗生素的每日摄入量(Acceptable daily intake,ADI)和最大残留限量(Maximum residue limit,MRL)做出了规定,以期管控动物源性食品及环境中的抗生素残留。现有的抗生素检测方法有高效液相色谱、毛细管电泳法、电化学分析仪及微生物分析法等,尽管上述方法灵敏度高、选择性好且检出限低,但也面临仪器昂贵、检测成本高、操作繁琐及测定时间长等不足,无法充分满足大批样品的现场过筛需求。因此,研发灵敏度高、选择性好且携带方便的抗生素残留检测新技术,将其用于交货时间短、批量大、批次多的动物源性食品样本检测,已成为当今国际食品安全、医疗卫生领域广泛关注的紧迫课题之一。比色生物传感器因其操作简便、成本低廉、结果直观的特点成为了抗生素残留检测研究领域的新热点,促使科研人员从液相和固相这两种介质入手对抗生素比色检测进行了大量研究。然而,现有液相检测体系通常都存在抗干扰能力不足、试剂储存条件苛刻、便携性差等问题;固相体系虽然在一定程度上提升了便携性和稳定性,但所获得的比色传感器仍存在灵敏度低、裸眼检测极限无法满足实际应用需求的缺陷。(1)本文针对上述关键问题进行了系统的研究和探索,依托静电纺纳米纤维膜的较高比表面积、丰富的孔结构、可控的堆积密度等优点,首次提出了基于静电纺纳米纤维的抗生素检测试纸,填补了静电纺纤维材料在抗生素传感器应用研究领域的空白,成功制备出了裸眼检测极限符合WHO对MRL限定标准的试纸材料。所取得的主要研究成果总结如下:以比表面积为11.39 m2/g的聚丙烯腈纳米纤维膜(PAN NFM)为比色传感试纸的模板基材,通过在其表面修饰羧甲基纤维(CMC)功能层,结合PAN NFM独特的孔道结构,使其具有优异的镍离子(Ni2+)吸附功能。进而基于Ni2+与土霉素间强烈的络合作用构建出可对不同浓度土霉素产生由浅绿至黄色的比色信号响应的试纸。所制得试纸条的裸眼检测为5 nM,响应时间为2 min,并具有良好的选择性及可重复使用性能(重复使用10个循环)。(2)结合药理学理论研究结果可知其他类金属离子如铁离子(Fe3+)、铜离子(Cu2+)也可与四环素(TC)类抗生素发生络合效应,因此本文受前述比色传感系统的启发,力图通过构建可吸附Fe3+、Cu2+的纳米纤维基模板材料的策略,进而设计出可对TC产生比色响应的试纸条。在Fe3+吸附模板材料的设计上,本文采用海藻酸盐(SA)对PAN NFM进行涂覆,利用SA与Fe3+发生配位络合组装形成TC响应表面(FAPAN)。而Cu2+吸附模板材料的设计则是采用乙二胺(EDA)对多孔PAN NFM进行修饰得以实现,组装获得的TC响应表面为CEPAN。研究结果表明,所设计的FAPAN测试条具备快速响应(10 min),裸眼检测限低(5μg/kg),抗干扰性能优异和可重复使用的综合特性,通过结合iPhone APP读取色度参数可获得TC浓度与颜色变化间的参数关联。然而,CEPAN试纸却无法对TC产生裸眼可视的颜色响应。(3)此外,本文还基于具有超高摩尔吸光系数的纳米金颗粒(AuNPs)开发了非酶式三聚氰胺-金纳米颗粒(M@Au)结合物探针比色系统,并成功将其应用于甲硝唑(MTZ)的比色检测。首先,首先以HAuCl4为金源,采用柠檬酸钠还原法成功制备出了平均直径为20.1±1.76 nm的AuNPs。通过将三聚氰胺标记于Au NP表面制成非酶MA@AuNPs探针。通过静电纺丝技术制备聚酰胺(PA6)纳米纤维膜,随后将非酶(M@Au)固载于PA6 NFM上。随后的传感测试表明,纳米纤维可在有效提升纳米金探针固定量的同时,促进了甲硝唑在纤维膜中的质能传递作用,使得该比色体系对甲硝唑的裸眼检测极限为2 nM,已能满足现有抗生素的严格检测标准。(4)选取卡那霉素为代表性目标抗生素物质,提出了非团聚式的适配体-AuNPs生物结合物探针系统,采用体外预筛选的卡那霉素核酸适配体作为响应原件以期提高体系的选择性,所选用的显色原件为平均粒径为17.5 nm的AuNPs采用经典Frens柠檬酸钠还原法合成。探针固载模板采用谷氨酸接枝的静电纺丝醋酸纤维素(CA)纳米纤维膜(G-CA)。G-CA NFM表面的羧酸基团为Apt@Au探针的有效固载提供位点,构建出夹心结构的比色响应平台。由于体系中存在卡那霉素时会引发Apt构象发生变化,导致Apt@Au探针解体,从而产生出由粉色至无色的比色信号响应。该生物试纸条可对2.580 nM的卡那霉素产生颜色响应,裸眼检出限可达2.5 nM。除优异的选择性,可重复使用性和长期可储存性外,该试纸条还可用于实际食品中抗生素的检测。
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