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一.miR-338-3p通过调控Runx2促进mDPC6T向成牙本质细胞样细胞分化研究目的：成牙本质细胞是一种非常特殊的终末分化细胞,由神经嵴来源的牙乳头细胞在一定的信号诱导下定向分化而成。在成牙本质细胞分化过程中许多信号通路、信号分子、转录因子和小分子RNA均参与了调控。MicroRAN是一类长度仅为20～25nt的非编码小分子RNA,在细胞的增殖、分化和器官形成发挥了重要作用。本研究试图探讨miR-338-3p在成牙本质细胞分化过程中的功能,及其具体的作用机制。研究方法：在本研究中,利用矿化诱导液在体外诱导小鼠牙乳头永生化细胞系即mDPC6T向成牙本质细胞样细胞分化作为模型。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-338-3p在成牙本质细胞分化过程中的表达趋势；同时利用慢病毒感染(lentivirus infection)和抑制齐刂(inhibitor)转染(transfection)的方法分别过表达和抑制miR-338-3p,然后加入矿化诱导液诱导14天,提取总RNA,检测miR-338-3p和成牙本质细胞分化相关基因I(Dspp, Dmpl和Alp)的表达趋势。Von kossa染色检测矿化结节形成。生物信息学预测Runx2可能为miR-338-3p的下游靶基因之一,通过qRT-PCR和western blot检测过表达和抑制miR-338-3p后Runx2的表达趋势,并利用双萤光素酶报告实验(DLA)检测报告基因的萤光素酶活性。研究结果：miR-338-3p在mDPC6T细胞向成牙本质细胞样细胞分化过程中呈显著的上调趋势。过表达miR-338-3p能促进成牙本质细胞分化相关基因Dspp, Dmpl和Alp的表达,并促进矿化结节的形成。相反,在抑制了miR-338-3p之后,能下调Dspp, Dmpl和Alp的表达,并抑制矿化结节的形成。通过qRT-PCR和western blot证实在过表达和抑制miR-338-3p之后能分别下调和上调Runx2的表达,DLA实验进一步表明,过表达miR-338-3p能有效的抑制Runx2报告基因的萤光素酶活性。结论：miR-338-3p通过结合在Runx2的3’-UTR区域,抑制Runx2的表达,促进成牙本质细胞分化。二.miR-338-3p通过调控Runx2和Fgfr2抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化研究目的：小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种可以自我更新和具有多向分化潜能的细胞。在不同的诱导条件下能分化成不同类型的细胞。在骨髓间充质干细胞中加入矿化诱导液能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化。成牙本质细胞和成骨细胞的前体细胞均来自神经嵴,二者的分化过程非常类似,我们的前期研究表明,miR-338-3p能够通过结合到Runx2的3’-UTR区域促进成牙本质细胞的分化,而Runx2又是参与成骨细胞分化的重要转录因子,那么miR-338-3p是否参与了成骨细胞的分化?本研究试图探讨miR-338-3p在成骨细胞分化过程中的功能,以及其在骨代谢相关疾病骨质疏松症中的作用。研究方法：本研究中,在小鼠原代骨髓间充质干细胞中加入矿化诱导液诱导其向成骨细胞方向分化,qRT-PCR验证成骨细胞分化相关基因(Runx2, Alp, Opn,Ocn和Coll)的表达趋势,并用茜素红染色(Alizarin Red staining)进一步确认此矿化诱导模型建立成功,然后用qRT-PCR检测miR-338-3p在此分化过程中的表达趋势。同时在小鼠骨髓原代细胞中分别感染慢病毒和转染抑制剂之后,诱导其分化至第七天,提取mRNA和microRNA,检测分化相关基因(Alp, Opn,Ocn和Coil)和miR-338-3p的表达。生物信息学预测Runx2和Fgfr2均为miR-338-3p的下游靶基因,通过qRT-PCR和western blot检测Runx2和Fgfr2的表达,并利用DLA实验检测Runx2和Fgfr2与miR-338-3p之间的直接作用关系。将性成熟小鼠双侧卵巢去除,与不去卵巢小鼠均在正常条件下培养十周后,取小鼠股骨,分别用HE染色和micro-CT验证此骨质疏松症模型是否建立成功。然后用qRT-PCR检测miR-338-3p、Runx2和Fgfr2的表达,同时利用western blot检测RUNX2和FGFR2蛋白质表达。然后在去势和对照小鼠骨髓原代细胞中转染miR-338-3p的抑制剂并诱导其分化后检测分化相关基因(Alp, Opn, Ocn和Coll)的表达。研究结果：qRT-PCR和茜素红染色实验证明,小鼠骨髓原代细胞向成骨细胞向分化模型建立成功,miR-338-3p在此分化过程中呈显著的下调趋势。过表达miR-338-3p能够抑制成骨细胞分化相关基因(Alp, Opn, Ocn和Coil)的表达,同时抑制矿化结节的形成,相反,在抑制了miR-338-3p之后能够促进成骨细胞分化相关基因的表达并促进矿化结节的形成。在过表达和抑制miR-338-3p之后能分别下调和上调Runx2和Fgfr2的表达,DLA实验进一步证实了miR-338-3p与Runx2和Fgfr2之间的直接作用关系。另外,Osx作为成骨细胞分化的另外一个转录因子,其表达也受到了影响,但是,Osx与miR-338-3p之间没有直接的结合位点。HE染色和micro-CT实验结果表明小鼠骨质疏松症模型建立成功,同时qRT-PCR证实miR-338-3p在去势小鼠中比正常小鼠中表达高,而Runx2和Fgfr2的表达趋势与miR-338-3p相反。在趋势小鼠和正常小鼠骨髓原代细胞中转染miR-338-3p抑制剂之后能在一定程度上挽救去势小鼠中相关基因的表达。结论：miR-338-3p通过调控Runx2和Fgfr2的表达来抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞向分化,miR-338-3p在小鼠骨质疏松症中能发挥一定的作用。