论文部分内容阅读
片姜黄是许多名老中医防治慢性肝炎、肝硬化和肝癌经验方中的主要药物之一,大量的实验研究表明姜黄、菖蒲、莪术和郁金等中药的提取物——姜黄素,具有抑制癌细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用。课题研究发现姜黄素可能通过上调lncRNA AK125910而抑制肝癌细胞的恶性生物学行为,从而调控肝癌的发生发展。研究目的：借助lncRNA表达谱芯片,筛选姜黄素对lncRNA的调控作用,进一步深入研究lncRNA AK125910在肝癌发生的调控作用以及姜黄素的干预机制。揭示lncRNA AK125910与肝癌的内在联系,以及姜黄素抑制肝癌细胞的作用与lncRNA AK125910的关系。研究方法：1.采用lncRNA芯片筛选姜黄素处理肝癌细胞的相关lncRNA,并使用荧光定量PCR和western blot技术进行验证；构建siRNA-AK125910瞬时转染肝癌细胞,下调lncRNA AK125910的表达。采用MTT法检测细胞凋亡,Brdu标记检测细胞增殖,Transewell检测细胞侵袭；2.使用生物信息学技术检测lncRNA AK125910的下游靶基因,并使用荧光定量PCR和western blot技术进行验证；3.在构建siRNA-AK125910瞬时转染肝癌细胞的基础上,检测与肝癌细胞增殖、侵袭相关的蛋白表达情况,对姜黄素调控lncRNAAK125910的分子机制初步探索。结果：1.使用lncRNA表达芯片,证实在姜黄素处理的肝癌细胞中,lncRNA的fold change>5的lncRNA有7条,其中有5条表达增高,包括AK125910、uc009ycs、HMlincRNA717、 chrX:149438637-149438034和chr7：155933475-155996100；而2条表达降低,包括chr1：17129210938-17129213215和AP1879664；其中AK125910的表达上调最明显,为9.78倍。RealtimePCR的结果显示,lncRNAAK125910的表达出现显著上调,为空白对照组的8.92±2.33倍(p<0.001),这与芯片结果一致,表明lncRNA AK125910在姜黄素诱导肝癌细胞凋亡中起到了调控作用。2.使用MTT、brdu标记和Transwell法检测了lncRNA AK125910在姜黄素诱导肝癌细胞中的作用研究,证实了lncRNAAK125910参与了姜黄素诱导肝癌细胞凋亡,抑制其增殖和侵袭转移的作用。3.通过生物信息学预测lncRNA AK125910的下游靶基因为MUC2和SPAG4,并由Relatime PCR和western blot验证lncRNAAK125910增强MUC2的表达而抑制SPAG4的表达。4.通过Relatime PCR和western blot对lncRNA AK125910在姜黄素抑制肝癌细胞增殖、侵袭相关蛋白表达的作用,lncRNA AK125910参与调控Bcl-2和BAX、caspase-3和-8、MMP-2和-9的表达。结论：1.肝癌细胞中lncRNA AK125910表达明显升高,姜黄素能下调肝癌细胞中lncRNA AK125910;2.下调lncRNA AK125910的表达,能抑制肝癌细胞凋亡,促进肝癌细胞增殖和侵袭,姜黄素通过上调lncRNA AK125910而促进细胞凋亡,抑制细胞增殖和侵袭；3. lncRNA AK125910增强MUC2的表达而抑制SPAG4的表达,同时参与调控Bcl-2和BAX、caspase-3和-8、MMP-2和-9的表达。4.姜黄素使肝癌细胞Bcl-2表达下降,而Bax表达增强,caspase-3和caspase -8表达增强,而MMP-2和MMP-9表达下降。下调lncRNA AK125910可以取消姜黄素上述作用,说明姜黄素通过lncRNA AK125910诱导肝癌细胞凋亡和抑制侵袭。