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目的:1.基于生物信息学挖掘、分析冠心病发病的潜在分子生物学机制,探寻其潜在生物标志物及治疗靶点。2.揭示中医辨治稳定性心绞痛痰瘀互结证优效作用的物质基础及关键作用靶点,以明晰丹蒌片及其加味发挥疗效的作用机制。3.完善循证医学与中医辨治结合的临床研究设计,充分体现中医病证结合、辨证论治的特色与优势,为中医药临床研究提供方法学借鉴。同时,优化现有诊疗方案,提高临床疗效,形成中医辨治稳定性心绞痛痰瘀互结证临床方案的高质量临床证据。材料与方法:1.基于生物信息学分析探讨冠心病发病机制的研究(1)从GEO数据库中检索人类动脉粥样硬化相关转录组表达谱基因集(GSE100927),利用R语言的limma包筛选与AS相关的差异表达基因。(2)利用R语言的WGCNA包构建权重基因共表达网络,并确定基因模块与样本分组表型数据的关系,找出与分组表型数据显著相关的模块作为目标模块,筛选出相关基因。(3)对差异表达基因和WGCNA分析所筛选出的基因取交集,获得共有的关键基因集。(4)利用Metascape数据库对差异基因和WGNCA共表达部分筛选出来的交集基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。(5)通过对差异基因进行GO和KEGG功能注释,从生物学角度分析与动脉粥样硬化病理改变相关的生物过程,从而筛选出与动脉粥样硬化密切相关的生物标志物。2.丹蒌片干预稳定性心绞痛痰瘀互结证血浆蛋白质标志物的研究(1)病例纳入及干预措施:纳入304例稳定性心绞痛痰瘀互结证患者,随机分为试验组(中医辨治组152例)和对照组(西医常规治疗组152例),病例来源于辽宁中医药大学附属医院、北京中医药大学东直门医院、陕西中医药大学附属医院、广西中医药大学第一附属医院、云南省中医医院、西南医科大学附属中医医院、上海中医药大学附属龙华医院、广州中医药大学第一附属医院、湖北省中医院、甘肃省中医院、成都中医药大学附属医院、黑龙江中医药大学附属第一医院十二家分中心的门诊。对照组接受西医常规治疗;试验组接受丹蒌片及其加味结合西医常规治疗,丹蒌片每次5片,相应兼证颗粒剂每个品种1袋/次,90-100℃的开水100ml溶解后温服,每日口服三次,连续干预6个月(24周)。在试验期间,所有受试病例不得使用治疗本病的规定以外的其它中医治疗方法(例如中药制剂、针灸治疗等)。(2)临床生物样本制备:分别于受试者入组的0、1(4周)、3(12周)、6(24周)个月采集外周静脉血4m L,离心提取血浆后置于-80℃冰箱长期低温保存待测。(3)利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测稳定性心绞痛痰瘀互结证受试者血浆IL-6、VCAM-1、MMP9、MPO、Ang-Ⅰ水平。(4)疗效指标评价:对试验组与对照组受试者血浆IL-6、VCAM-1、MMP9、MPO、Ang-Ⅰ水平进行统计分析。3.丹蒌片干预稳定性心绞痛痰瘀互结证蛋白质标志物m RNA表达的研究(1)病例纳入及干预措施:纳入26例稳定性心绞痛痰瘀互结证患者,随机分为试验组(中医辨治组12例)和对照组(西医常规治疗组14例),病例来源于辽宁中医药大学附属医院、北京中医药大学东直门医院。对照组接受西医常规治疗;试验组接受丹蒌片及其加味结合西医常规治疗,丹蒌片每次5片,相应兼证颗粒剂每个品种1袋/次,90-100℃的开水100ml溶解后温服,每日口服三次,连续干预6个月(24周)。在试验期间,所有受试病例不得使用治疗本病的规定以外的其它中医治疗方法(例如中药制剂、针灸治疗等)。(2)临床生物样本的制备:分别于受试者入组的0、1(4周)、3(12周)、6(24周)个月采集患者外周静脉血4m L,分离、提取外周血白细胞放入-80℃的冷冻柜中冻存,留待实时荧光PCR仪的检测。(3)利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术检测稳定性心绞痛痰瘀互结证患者外周血白细胞中Ang-Ⅰ、IL-6、MPO、MMP-9、VCAM-1五个指标m RNA的表达情况。(4)疗效指标评价:对试验组与对照组患者外周血白细胞中Ang-Ⅰ、IL-6、MPO、MMP-9、VCAM-1五个指标m RNA的表达情况进行统计分析。结果:1.基于生物信息学分析探讨冠心病发病机制的研究结果(1)本研究通过差异表达分析,筛选出与AS病变高度相关的差异基因441个。其中,MMP9为与动脉粥样硬化样病理改变高度相关的上调表达基因。(2)通过加权基因共表达网络分析,筛选出与分组表型显著相关的模块turquoise(相关系数=0.73,P<0.001),获得模块内具有协同作用的基因976个。(3)将WGCNA分析所筛选出的基因与441个差异表达基因取交集,获得282个差异共表达基因。(4)对获得差异共表达基因进行GO和KEGG功能注释,发现这些差异表达的基因主要参与白细胞活化的调节、免疫系统过程的负调节、细胞因子产生的调节、免疫应答的正向调节、白细胞分化、髓系白细胞活化、白细胞迁移、吞噬作用、防卫反应的调节、髓样白细胞分化、细胞因子介导的信号通路、ERK1和ERK2级联的调节、白细胞介素-6的产生、干扰素γ产生、参与炎症反应的分子介质的产生、toll样受体信号通路、巨噬细胞活化、抗原刺激的炎症反应、水解酶活性的正调控、白细胞介导的细胞毒性等生物过程。(5)本研究结合动脉粥样硬化的慢性炎症病变过程,参考相关文献,认为MMPs、黏附分子、IL-6、髓过氧化物酶等炎症生物标志物在动脉粥样硬化斑块炎性病变的进程中起重要作用,筛选出MMP-9(基质金属蛋白酶-9)、IL-6(白细胞介素-6)、VCAM-1(血管细胞粘附分子-1)、MPO(髓过氧化物酶)、Ang-1(血管紧张素-1)五个炎症指标用以后续实验研究。2.丹蒌片干预稳定性心绞痛痰瘀互结证血浆蛋白质标志物的研究结果(1)分中心及病例分布情况由于试验过程中有4名受试者脱落,故本研究最终共纳入300例患者进行统计分析,其中试验组151例,对照组149例,病例来源于全国七大地区12家分中心,各分中心病例数均占8%左右,每个分中心试验组与对照组病例数相当,病例来源广泛,分布较为均衡,具有一定的代表性。(2)人口学资料情况300例患者在人口学资料方面,组间比较差异无统计学意义(P>0.05),基线均衡,具有可比性。(3)疗效指标评价1)全分析集疗效分析两组治疗后血浆IL-6、VCAM-1、MMP-9、Ang-1、MPO水平均较本组治疗前降低(P<0.01),且中医辨治组降低更明显(P<0.01),中医辨治组较西医常规治疗的组间疗效具有显著性统计学差异。故可以认为两组疗效不同,中医辨治组疗效更显著,表明丹蒌片及其加味可以显著降低患者血浆IL-6、VCAM-1、MMP-9、Ang-1、MPO水平,且疗效较西医常规治疗组明显。2)符合方案集疗效分析两组治疗后血浆IL-6、VCAM-1、MMP-9、Ang-1、MPO水平均较本组治疗前降低(P<0.01),且中医辨治组降低更明显(P<0.01),中医辨治组较西医常规治疗的组间疗效具有显著性统计学差异。故可以认为两组疗效不同,中医辨治组疗效更显著,表明丹蒌片及其加味可以显著降低患者血浆IL-6、VCAM-1、MMP-9、Ang-1、MPO水平,且疗效较西医常规治疗组明显。(4)安全性分析中医辨治组与西医常规治疗组所有不良事件的发生、不良事件严重程度、严重不良事件的发生例次、例数和发生率组间比较无显著统计学差异(P>0.05)。两组患者血常规、肝功能、肾功能、尿常规、便常规安全性评估项目各访视点组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),且治疗后(访视4)与基线比较变化不显著,且无恶化,提示丹蒌片具有良好的安全性。3.丹蒌片干预稳定性心绞痛痰瘀互结证蛋白质标志物m RNA表达的研究结果(1)人口学资料情况26例患者在人口学资料方面,组间比较差异无统计学意义(P>0.05),基线均衡,具有可比性。(2)疗效指标评价丹蒌片及其加味能下调稳定性心绞痛痰瘀互结证患者的IL-6、VCAM-1、MMP9、MPO、Ang-Ⅰm RNA表达,且具统计学意义(P<0.01)。结论:1.从生物信息角度揭示了炎症反应为冠心病发病的关键分子生物学机制,认为IL-6、VCAM-1、MMP9、MPO、Ang-Ⅰ可能为冠心病的生物标志物及潜在作用靶点。2.从蛋白质层面揭示了IL-6、VCAM-1、MMP9、MPO、Ang-Ⅰ为丹蒌片及其加味发挥中医辨治优效的物质基础;从m RNA层面,明晰了IL-6、VCAM-1、MMP9、MPO、Ang-Ⅰ为丹蒌片及其加味发挥作用的关键作用靶点,推断其可能通过调控NF-κB下调下游相关炎症因子IL-6、VCAM-1、MMP9等表达;通过下调Ang-Ⅰ、MMP-9抑制Ang-Tie2、VEGF/VEGFR信号通路,以抑制炎症反应,调整内皮功能、稳定斑块,延缓动脉粥样硬化病理进程,从而发挥治疗作用。3.本研究选用多中心实用性随机对照试验方法,采取优效性设计,充分体现出中医病证结合,辨证论治的特色与优势,为中医药临床研究提供了方法学借鉴。同时,为中医辨治稳定性心绞痛痰瘀互结证提供了高质量循证证据,在西医常规治疗的基础上结合中医辨治方案,能够提高临床疗效,为丹蒌片及其加味的中医辨治方案推广应用于临床提供依据。